陳 希， 鄢雷娜， 劉緒平， 肖欽欽， 段和祥， 陳偉康*

(江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西南昌 330029)

藥物分子的手性與藥物的藥理活性、毒性及藥代動力學性質有著密切關系。當手性藥物的對映體進入生物體內，將作為不同的分子加以識別匹配，因此對映體在藥效學、藥動學和毒理學方面存在立體選擇性，致使其生物活性、代謝過程及毒性方面均可能存在明顯差異，最典型的例子為上世紀60年代的“反應?！笔录1,2]。鑒于手性化合物對映體的藥理活性和毒性往往有很大差異，開展對映體化學(純度鑒別、檢查等)、藥理學、毒理學以及臨床應用等研究是非常有必要的，且具有重要意義。然而欲開展這些工作，必須首先解決對映體拆分問題，因此建立手性分離分析方法成為開展手性藥物研究過程中的關鍵一環(huán)[3]。

普盧利沙星(Prulifloxacin)是日本新藥公司開發(fā)研制的第四代喹諾酮類廣譜抗生素，該藥對革蘭氏陰性和陽性菌、厭氧菌、衣原體和支原體等都具有廣泛的殺菌和抑菌作用，臨床主要用于治療呼吸道感染、泌尿道感染、皮膚軟組織感染[4,5]。普盧利沙星分子結構有一個手性碳，見圖1。有報道左旋普盧利沙星及其生理上允許的鹽可以替代現(xiàn)有抗菌藥物普盧利沙星及生理上允許的鹽，其不但抗菌作用明顯增強，而且毒性小[6]。為了解藥物中左右旋普盧利沙星的比例，有必要建立相應的對映體拆分方法，但目前尚無該藥對映體的拆分報道。手性配位交換流動相添加劑法，系在流動相中添加某種手性配體(多采用手性氨基酸)和金屬離子，與待測的對映體配位形成兩個非對映的三元絡合物，在非手性固定相的色譜柱(如C18色譜柱)上進行對映體的拆分[7,8]。已經(jīng)有文獻對莫西沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、尤利沙星等手性喹諾酮藥物對映體進行了拆分測定[9 - 13]。本文選用L-異亮氨酸和CuSO4作為手性添加劑，使用普通C18色譜柱對普盧利沙星對映體進行拆分研究。

圖1 普盧利沙星的化學結構式

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

LC-20AD XR高效液相色譜儀(日本，島津公司)；MS205DU電子天平(瑞士，梅特勒-托利多公司)。

普盧利沙星對照品(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：XM8QF-TS，含量：98.0%)。L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸為生化試劑，甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。水為超純水。

1.2 溶液配制

稱取普盧利沙星對照品105.32 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液(含普盧利沙星1032.1 μg/mL)。取上述溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液1 (含普盧利沙星206.4 μg/mL)。稱取普盧利沙星對照品102.12 mg，置于100 mL容量瓶中，加乙腈20 mL使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻。取該溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液2 (含普盧利沙星200.2 μg/mL)，臨用新配，4 ℃保存。

1.3 色譜條件

色譜柱：月旭Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：L-異亮氨酸-CuSO4溶液(含8 mmol/L 的L-異亮氨酸和4 mmol/L的CuSO4，用NaOH溶液調節(jié)溶液pH至3.5)-甲醇(68∶32，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：276 nm。

2 結果與討論

2.1 稀釋劑和進樣體積對拆分的影響

取對照品溶液1，當進樣體積為10 μL時，普盧利沙星兩個對映體的峰形特別差，理論塔板數(shù)(N)和分離度(RS)均不太滿意，且有較大的溶劑峰。取對照品儲備溶液和對照品溶液2，分別進樣2 μL和10 μL，兩種方式進樣普盧利沙星兩個對映體峰間的RS約為3.61和3.78，普盧利沙星峰形幾乎無差異，只是乙腈為稀釋劑時溶劑峰較大。色譜圖見圖2。上述差異主要原因可能為乙腈對三元絡合物的形成有干擾，乙腈稀釋的對照品溶液進樣體積減少到2 μL時，普盧利沙星對映體峰形可以得到較好改善。使用流動相稀釋時普盧利沙星放置3 h后降解1.8%，而使用乙腈稀釋時普盧利沙星幾乎不降解，所以如選用流動相稀釋時需臨用新配。

圖2 普盧利沙星對照品的色譜圖

2.2 手性流動相添加劑對拆分的影響

不同手性配體的手性拆分能力差異較大，本文分別考察了L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸作為手性配體的拆分情況。選擇質量濃度約為1032.1 μg/mL的普盧利沙星對照品儲備溶液，進樣量2 μL進行實驗。結果表明：使用L-脯氨酸時普盧利沙星僅有1個色譜峰，無法拆分普盧利沙星對映體；使用L-苯丙氨酸和L-異亮氨酸時，色譜圖中普盧利沙星有2個色譜峰，可以實現(xiàn)普盧利沙星對映體的拆分。L-苯丙氨酸拆分普盧利沙星對映體時保留時間較長，增加甲醇比例至36%，考察普盧利沙星對映體保留時間近似時，兩個對映體峰間RS，使用L-異亮氨酸可以獲得更佳RS，見表1。

表1 不同手性氨基酸對保留時間和分離度的影響

2.3 L-異亮氨酸濃度對拆分的影響

L-異亮氨酸濃度的增加可以增加流動相中L-異亮氨酸和Cu2+二元絡合物的濃度，可使流動相中產生更多的二元絡合物用于色譜柱固定相上的分配，進而提高普盧利沙星對映體峰間RS[14]。但由于L-異亮氨酸和CuSO4手性添加劑在276 nm波長也有紫外吸收，L-異亮氨酸濃度過高造成流動相在276 nm吸收值過大(背景吸收)，樣品分析時普盧利沙星對映體峰高和峰面積會減少，所以需要找到適宜的L-異亮氨酸濃度。保持L-異亮氨酸和CuSO4濃度比為2∶1，考察L-異亮氨酸濃度為6～12 mmol/L時對普盧利沙星對映體拆分的影響。實驗表明L-異亮氨酸濃度為8 mmol/L時有較好RS，峰面積(A)的減少也不太大，結果見表2。

表2 L-異亮氨酸濃度對拆分的影響

2.4 金屬離子濃度對拆分的影響

Cu2+與配位體比例的不同，同樣會影響對映體拆分效果[15]。維持8 mmol/L L-異亮氨酸濃度不變，探尋最佳Cu2+濃度。結果顯示，Cu2+濃度為3 mmol/L時，普盧利沙星對映體峰間RS相比4 mmol/L時只增加了0.1，但是分析時間需要延長到近30 min，結果見表3。綜合考慮，最終選擇CuSO4的濃度為4 mmol/L。

表3 CuSO4濃度對拆分的影響

2.5 流動相pH對拆分的影響

流動相pH對拆分的影響也很大，呈堿性有利于絡合物的形成，一般堿性流動相比酸性時獲得更高的容量因子和RS[16]。但流動相pH大于3.5后，Cu2+絡合物沉淀產生速度明顯加快，所以考察流動相pH在3.0～3.5間變化對拆分的影響。結果顯示pH值越大，普盧利沙星對映體峰間RS越大，pH為3.5時具有最好的RS，結果見表4。

表4 流動相pH對保留時間和分離度的影響

2.6 有機改性劑對拆分的影響

不同的有機溶劑對拆分效果也有較大的差異，本實驗中使用甲醇可以獲得較好的拆分效果。但有機相使用乙腈時無法拆分普盧利沙星對映體，色譜圖見圖3。

圖3 以乙腈為有機相的普盧利沙星對照品色譜圖

3 結論

本研究通過優(yōu)化流動相中配體種類、濃度、比例以及pH等參數(shù)，得到了拆分普盧利沙星對映體的最佳流動相組成：8 mmol/L L-異亮氨酸和4 mmol/L CuSO4溶液(pH=3.5)-甲醇(68∶32，V/V)，成功建立手性配位交換色譜流動相添加劑法拆分普盧利沙星對映體的方法。該方法選擇性高，前處理簡單、經(jīng)濟，容易普及。