李發(fā)蘭 李愛玲

（1，山東省蒙陰縣畜牧發(fā)展促進中心 276200；2，齊魯動物保健品有限公司 250100）

脂肪組織除了儲存能量外還具有重要的內分泌功能，可分泌脂質、蛋白質和miRNAs 等多個旁分泌內分泌信號因子，對脂肪組織本身及非脂肪組織的功能、全身代謝調節(jié)和胰島素敏感性等方面具有重要作用[1-4]。加之目前肥胖人群的數(shù)量激增[5]，出于科研和健康方面的考慮，脂肪已成為目前的研究熱點。

脂肪細胞是脂肪組織的主要組分，而其前體-前體脂肪細胞是由脂肪祖細胞衍生而來的特異化多能細胞，在適宜的條件下，在大量的細胞因子及信號通路的共同作用下，最終成為含有大脂滴的脂肪細胞[6]。葡萄糖在成脂分化過程中具有重要作用，它是脂肪從頭合成的原材料和能量主要來源，其代謝產(chǎn)物還可以參與調節(jié)多個脂肪代謝相關基因的表達[7]。體外研究不同濃度葡萄糖對脂肪細胞成脂分化的研究很少。

本研究以7 日齡實驗用小型豬皮下脂肪組織為試驗材料，利用膠原酶法分離前體脂肪細胞，利用高、低葡萄糖濃度的DMEM 進行體外培養(yǎng)和成脂分化，以期對深入研究葡萄糖影響脂肪細胞體外分化的分子機制提供試驗素材。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

脂肪組織來源于7 日齡實驗用小型豬仔豬背部皮下；胎牛血清、DMEM、PBS、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液購自Gibco；胰島素、地塞米松、IBMX 購自（Sigma 公司）；細胞增殖檢測試劑盒（CellTiter 96RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay）購自Promega；甘油三酯酶法測定試劑盒購自普利萊（北京）基因技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；實時熒光定量PCR 試劑購自羅氏（中國）有限公司；Western blotting 所需試劑、抗體與耗材分別購自Bio-rad 和北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 原代細胞的分離培養(yǎng)

麻醉處死7 日齡實驗用小型豬仔豬，剃除背部被毛，采集皮下脂肪組織，經(jīng)過含有5×青鏈霉素混合液的PBS 反復沖洗5次后，在超凈臺中去除脂肪組織中的血管和周邊的筋膜，將組織塊剪碎成1mm3 的組織糜，加入2 倍體積的0.1% I 型膠原酶，37℃恒溫水浴鍋內水浴消化1h，用100 目篩網(wǎng)過濾去除未消化組織，過濾液1500r/min 離心10min，棄上清，用DMEM液懸浮沉淀物，洗滌2 次后，用含有10%血清和1×雙抗的高濃度葡萄糖（4500mg/L，簡標為H）DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，接種到培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后換液去除未貼壁細胞，每隔48h 更換新的培養(yǎng)液。

1.3 脂肪細胞的傳代培養(yǎng)及誘導分化

待細胞長至匯合后移除培養(yǎng)液，用PBS 洗滌后加入0.25%胰蛋白酶進行消化，待細胞縮成球形時加入完全培養(yǎng)液終止消化，吹打細胞使之懸浮，將懸液1500r/min 離心去除上清，分別用含有10%血清和1×雙抗的高濃度葡萄糖（4500mg/L）和低濃度葡萄糖（1000mg/L，簡標為L）DMEM 培養(yǎng)基懸浮細胞并傳代至新的培養(yǎng)皿。

1.4 細胞生長增殖情況

取生長狀態(tài)良好的細胞，胰蛋白酶消化，分別用高糖和低糖細胞培養(yǎng)液制成細胞懸液后計數(shù)。將等量的細胞傳代至96孔板，每隔24h 測定取3 孔細胞分別進行增殖測定，將20uLMTS 液添加到細胞培養(yǎng)液中，小心混勻，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3h，在酶標儀中檢測各孔490nm 的吸光值。

1.5 體外誘導分化

細胞完全匯合后加入誘導液I（含有10%血清，0.5mM IBMX，1uM DEX，10ug/ml Insulin 的高、低葡萄糖DMEM 液）并于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h 后移除誘導液I 換成只含有胰島素的誘導液II，之后每48h 換液。

1.6 油紅O 染色

參照Ramirez 等的方法進行[8]，從培養(yǎng)箱中取出分化至第8 天的細胞，用PBS 洗滌細胞3 次，加入4%多聚甲醛固定液，37℃固定30min，加入油紅O 工作液置，37℃孵育20min，再次用PBS 洗去未進入細胞的油紅O，鏡下觀察染色情況。

1.7 甘油三酯含量測定

從培養(yǎng)箱中取出分化至第8 天的細胞，用PBS 洗滌細胞2次，胰酶消化后，離心收集細胞，按照甘油三酯酶法測定試劑盒進行，在繪制標準曲線的基礎上測定樣品細胞中甘油三酯的濃度。

1.8 RNA 提取及實時熒光定量PCR

利用TRIzol 法提取分化至第8 天的脂肪細胞總RNA，反轉錄后進行成脂標志基因C/EBPα、PPARγ 的實時定量，以GAPDH 為內參，采用2--△△CT法計算其相對表達量。引物序列如表1 所示。

表1 引物信息

1.9 Western blotting 檢測成脂關鍵因子表達

利用RIPA 裂解液裂解分化至第8 天的脂肪細胞，測定蛋白濃度后進行，取等量蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后進行抗體結合，利用化學發(fā)光法進行目的條帶顯示。

1.10 統(tǒng)計學分析

試驗均重復3 次，采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，組間采用t 檢驗進行基因表達差異顯著性分析，** 表示差異極顯著（＜0.01），* 表示差異顯著(＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 實驗用小型豬前體脂肪細胞形態(tài)學觀察

細胞經(jīng)過培養(yǎng)1d 后開始出現(xiàn)貼壁細胞（圖1A），用PBS洗滌去掉未貼壁的雜細胞，貼壁的細胞開始逐漸生長，至第3天細胞成長至梭形（圖1B），5d 左右細胞呈旋渦狀生長（圖1C），之后逐漸呈現(xiàn)生長抑制。

圖1 前體脂肪細胞的形態(tài)

2.2 葡萄糖濃度對前體脂肪細胞增殖的影響

對分離后的細胞進行傳代，每隔24h 測定一次細胞增殖情況，結果顯示，從傳代后的第3 天開始，高葡萄糖組（4500mg/L）細胞增殖能力顯著高于低葡萄糖組（1000mg/L）的細胞增殖能力（＜0.05）。

表2 葡萄糖濃度對前體脂肪細胞增殖的影響

2.3 葡萄糖濃度對前體脂肪細胞體外成脂分化的影響

待細胞匯合后，向培養(yǎng)基中加入誘導液誘導分化，8d 后進行油紅O 染色，染色結果如圖2 所示，高葡萄糖組細胞成脂分化能力強于低葡萄糖組，利用甘油三酯測定試劑盒對脂滴含量進行測定，發(fā)現(xiàn)甘油三酯含量極顯著高于低葡萄糖組（＜0.01）。

圖2 葡萄糖濃度對前體脂肪細胞成脂分化的影響

2.4 葡萄糖濃度對成脂標志基因表達的影響

由圖4 可知，與低葡萄糖組相比，高葡萄糖組脂標志基因PPARγ 和C/EBPα 的轉錄水平和表達量均顯著增加（＜0.05）。

圖3 葡萄糖濃度對脂肪細胞甘油三酯含量的影響

圖4 葡萄糖濃度對成脂標志基因轉錄和表達的影響

3 討論

前體脂肪細胞的體外誘導分化可以在一定程度上模擬脂肪生成，可以直觀探索多種調控因子對成脂的調控，在近些年的研究中備受關注[9,10]，因此，有必要建立前體脂肪細胞的體外分離和誘導分化體系。

原代脂肪細胞的分離培養(yǎng)多采用組織塊法，這種方法分離的時間較長，雖不易污染，但細胞成活率低且生長較慢，不利于后續(xù)研究[11]。本試驗利用膠原酶消化法對實驗用小型豬背部皮下組織中的前體脂肪細胞進行了分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在去除未貼壁細胞后，分離的細胞在培養(yǎng)第3 天即出現(xiàn)“纖維樣”形態(tài)，但隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞匯合后出現(xiàn)接觸抑制。

葡萄糖不僅可以為脂質合成提供能量，還可以調節(jié)碳水化合物反應元件結合蛋白的表達，從而影響脂質生成和糖酵解[7]；葡萄糖代謝產(chǎn)物丙酮酸是脂肪酸合成起始物乙酰輔酶A的底物[12]，因此，葡萄糖在成脂分化過程中具有重要作用。正常人空腹血糖值為3.9～6.0mmol/L，豬的血糖值也在該區(qū)間內[13]。常用細胞培養(yǎng)的DMEM 培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為1000mg/L 或4500mg/L，前者處于人、豬正常的血糖水平區(qū)間，后者遠高于正常區(qū)間，有必要比較二者對細胞增殖和分化的影響和差異。本研究對匯合后的細胞進行傳代，傳代對分離的細胞進行初步純化，以含有高濃度葡萄糖（4500mg/L）和低濃度葡萄糖（1000mg/L）的DMEM 為基礎液培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與低葡萄糖組相比，高葡萄糖組細胞在傳代后第3 天后增殖能力顯著提高，說明培養(yǎng)液中高濃度葡萄糖提供的能量為細胞生長和增殖提供保障。

偶氮染料油紅O 具有很強的親脂性，可與細胞內甘油三酯進行結合并溶解在脂滴中，形成紅色的小脂滴，因此，可通過肉眼觀察脂滴的大小和數(shù)量來直觀評價成脂分化效果。用含高、低濃度葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液配制體外誘導液，對前體脂肪細胞進行體外誘導分化，對誘導第8 天細胞進行油紅O 染色，油紅O 發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖組在脂滴數(shù)明顯高于低葡萄糖組，進而對甘油三酯含量進行定量，進一步驗證了觀察到的結果。

成脂分化是一個需要多個基因和通路參加的復雜過程，其中PPARγ 和C/EBPα 具有重要作用，常作為成脂分化的標志基因[14,15]。本試驗實時熒光定量PCR 和Western blotting 結果均表明高葡萄糖組PPARγ 與C/EBPα 的表達量顯著高于低葡萄糖組，與油紅O 染色和甘油三酯結果一致，說明高濃度的葡萄糖能促進前體脂肪細胞中成脂分化基因的表達，進而影響脂質沉積。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，與低濃度葡萄糖組相比，高濃度的葡萄糖對實驗用小型豬前體脂肪細胞的增殖和成脂分化具有促進作用，為進一步研究葡糖糖對脂肪細胞分化的分子機制提供了試驗材料。