Bax抑制因子1（BI-1）是重要的細胞凋亡抑制因子。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BI-1與血管鈣化密切相關(guān)，血管鈣化中，BI-1蛋白表達下降，細胞鈣含量、堿性磷酸酶活性、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx-2）、細胞凋亡增加；過表達BI-1蛋白后細胞鈣含量、堿性磷酸酶活性、Runx-2、細胞凋亡減少，血管鈣化減輕。但BI-1通路的下游調(diào)控蛋白并未清楚。視神經(jīng)萎縮蛋白1（OPA1）作為介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜融合的主要因子，在維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。前期研究結(jié)果顯示血管鈣化下調(diào)OPA1蛋白表達，線粒體融合減少，線粒體損傷增加，鈣沉積、Runx-2蛋白表達、細胞凋亡率增加，而過表達OPA1能促進線粒體融合，抑制鈣沉積、細胞骨型分化和凋亡，減輕血管鈣化。

此外，哈爾濱工業(yè)大學(xué)的高波和金明生等分別于2005年和2009年提出了利用氣囊進行拋光的力控末端執(zhí)行器，如圖12所示。工作時，通過對氣囊壓力進行實時調(diào)節(jié)，可改變或保持橡膠氣囊與模具表面的接觸力和接觸區(qū)的壓力分布。該裝置具有柔性好、與工件接觸充分和適用范圍廣等優(yōu)點[16-22]。

BI-1 是線粒體形態(tài)和功能的重要調(diào)節(jié)蛋白。BI-1能調(diào)控心肌微血管內(nèi)皮細胞線粒體融合－分裂，保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能，減少氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡。在急性腎損傷中，腎小管上皮細胞BI-1表達下調(diào)，線粒體分裂增加；上調(diào)BI-1表達后，線粒體分裂減少，氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡減輕。但BI-1蛋白是否直接影響OPA1蛋白表達？BI-1是否通過OPA1抑制鈣沉積、細胞骨型分化和細胞凋亡，進而減輕血管鈣化，這些問題尚未見研究。因此，本研究構(gòu)建小鼠血管鈣化模型，并探究BI-1如何通過調(diào)控OPA1蛋白影響血管鈣化。

1 材料和方法

1.1 材料

ApoE小鼠、BI-1；ApoE小鼠、BI-1；OPA1；ApoE小鼠（北京賽業(yè)生物公司）。動物實驗規(guī)程已獲批準，符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

HE染色試劑盒（北京索萊寶公司）；von Kossa染色試劑盒（北京索萊寶公司）；TUNEL試劑盒（羅氏）；鈣含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BI-1、OPA1、Runx-2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）和β-肌動蛋白（β-actin，Abcam）。SDS-PAGE凝膠電泳儀（Bio-Rad）、光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較作獨立樣本檢驗，計數(shù)資料以百分數(shù)表示，組間比較采用χ檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

取主動脈組織制備勻漿，加入細胞裂解液裂解30 min，BCA法檢測蛋白濃度，經(jīng)上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉后，加入一抗（BI-1 抗體、OPA1 抗體、Runx-2 抗體、BMP-2抗體、活化的caspase-3抗體均按1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后使用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000）室溫孵育2 h。沖洗后，暗室曝光，掃描條帶。使用Image J軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參。

由于政府對土地使用權(quán)的劃分相互交織，政府的土地使用權(quán)年齡不合理，不僅限制農(nóng)民自身的發(fā)展，影響農(nóng)村發(fā)展，也制約了城鎮(zhèn)化的發(fā)展。在我國，施行的農(nóng)民土地承包制的使用年限比較短，使村民在土地上的生產(chǎn)經(jīng)營活動沒法進行長遠有效的規(guī)劃，這也限制了中國農(nóng)村土地的健康發(fā)展。根據(jù)國家有關(guān)部門頒布的政策，限制土地的合同管理權(quán)和宅基地使用權(quán)的轉(zhuǎn)讓也是非常明確的，因此農(nóng)民也沒法充分利用土地來提升自己的經(jīng)濟水平。農(nóng)民自身來講，也不能充分利用土地的流轉(zhuǎn)進行資金流動，阻礙了我國城鎮(zhèn)化的發(fā)展[3]。

1.3 小鼠鈣化模型的建立和分組

8周ApoE小鼠，禁食不禁水12 h后，于腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（50 mg/kg），1次/d，連續(xù)5 d。如連續(xù)2 d測量血糖≥250 mg/dL，則認為糖尿病小鼠模型成功。高糖高脂飼料喂養(yǎng)12周后，開始腹腔注射N-（1-羧甲基）-L-賴氨酸促進斑塊鈣化，注射劑量為60 μg/次，連續(xù)注射16周，取其主動脈弓用于實驗。實驗分為4組（=6）：Control組（ApoE小鼠普通飼料喂養(yǎng)），VC組（ApoE小鼠建立鈣化模型），VC+BI-1組（BI-1；ApoE小鼠建立鈣化模型）和VC+BI-1+OPA1組（BI-1；OPA1；ApoE小鼠建立鈣化模型）。

1.4 小鼠主動脈血管平滑肌細胞培養(yǎng)和鈣化模型的建立

無菌條件下取出C57BL/6、BI-1或者BI-1；OPA1小鼠主動脈，剪成小組織塊，置于培養(yǎng)皿底部，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等到細胞達到80%融合的時候即可傳代用于試驗。經(jīng)α-SMA免疫組織化學(xué)染色鑒定純度＞95%。

血管平滑細細胞長至融合狀態(tài)后用于實驗，在常規(guī)培養(yǎng)基（10%DEME細胞培養(yǎng)液）中加入10 mmol/L β磷酸甘油（β-GP）和7.2 mmol/L 氯化鈣，每隔2 d換1次液體，連續(xù)培養(yǎng)14 d，建立血管平滑肌細胞鈣化模型。

1.5 小鼠血清血脂、血糖檢測

小鼠摘取眼球取血，4 ℃下3000 r/min離心10 min，取上清液，使用BECKMAN COULTER Au2700全自動生物化學(xué)儀分析血糖、血甘油三酯、血膽固醇水平。

要實現(xiàn)信息化的會計教學(xué)就必須重視采用實踐性教學(xué)方法，會計是一門實踐性極強的學(xué)科，除了理論教學(xué)之外，必須十分注重實踐化教學(xué)，讓理論與實踐結(jié)合起來。例如多讓學(xué)生進行上機訓(xùn)練，多進行實習(xí)鍛煉，這樣才能將會計理論應(yīng)用到實際工作中去。但是在會計教學(xué)過程中往往忽略了實踐教學(xué)，未能很好地將理論教學(xué)與實踐教學(xué)結(jié)合，學(xué)校未能較好地與企業(yè)合作，形成一些長期穩(wěn)定的實踐基地，同時也未能較好地組織學(xué)生進行實踐活動，實習(xí)活動往往都流于形式。這樣的教學(xué)模式勢必會造成學(xué)生與實際脫鉤，無法滿足市場和企業(yè)的需求，這對于培養(yǎng)合格的會計信息化人才來說存在較大的難度。所以學(xué)校一定要提高會計教學(xué)的實踐意識。

1.6 HE染色和von Kossa染色

HE染色：小鼠主動脈弓經(jīng)4%多聚甲醛固定后，然后進行包埋、切片、脫蠟、脫水、HE染色處理，于普通光學(xué)顯微鏡下拍照記錄。von Kossa染色：組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水后，置于硝酸鹽溶液中照射30 min進行染色，蒸餾水清洗3次后，使用硫代硫酸鈉溶液定影和中性品紅復(fù)染，蒸餾水再次沖洗后于顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況，使用Image-Pro Plus分析鈣鹽沉積面積百分比。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測Runx-2和BMP-2表達量

《標準化法》第25條的禁止性規(guī)定，聯(lián)結(jié)第26條的出口產(chǎn)品與服務(wù)的豁免規(guī)定，可以從解釋學(xué)上發(fā)現(xiàn)，對于不符合強制性標準的產(chǎn)品而言，不得生產(chǎn)與銷售二者之間，是一組并列的不可拆分的聯(lián)合適用條件，而進口或提供二者之間，則是可拆分的選擇適用的關(guān)系。這也是本文的一個微細的發(fā)現(xiàn)。

取組織石蠟切片，檸檬酸緩沖液中修復(fù)后，BSA封閉液封閉，然后滴加一抗抗體Runx-2（1∶300）或BMP-2（1∶300），4 ℃孵育過夜，蒸餾水沖洗3次，然后滴加二抗抗體，37 ℃孵育1 h，蒸餾水沖洗3次，滴加DAB顯色，然后復(fù)染、脫水、封片，在顯微鏡下觀察并拍照。每張切片取5個高倍鏡視野，計算Runx-2或BMP-2陽性面積百分率。

1.8 主動脈組織鈣含量的測定

金華寺湯溪鎮(zhèn)寺平古村主要的保護模式為劃歸為文物，售票觀覽。單一的盈利方式導(dǎo)致未來面臨的困境是可以預(yù)見的，如何打開瓶頸投入活化更新項目，促進傳統(tǒng)村落可持續(xù)發(fā)展是值得思考的問題。但還要防止進入另外一個誤區(qū)，即在中國的許多傳統(tǒng)村落，由沿街商鋪的商戶構(gòu)成的多以游客市場篩過“經(jīng)得起市場檢驗”的特色小食、區(qū)域特產(chǎn)、文藝小鋪以及飾品首飾為主流的產(chǎn)業(yè)［1］。這些所謂的“主流”沒有地域特色，很難成長為支撐傳統(tǒng)村落持續(xù)發(fā)展的產(chǎn)業(yè)。

要借助互聯(lián)網(wǎng)的優(yōu)點，把電視臺節(jié)目的傳播做到最大化，全面提高節(jié)目的傳播度，使節(jié)目的受眾群體不再是電視機前的用戶，更要讓互聯(lián)網(wǎng)用戶也能夠及時獲取電視節(jié)目中的信息，從而提高電視節(jié)目的影響力，擴寬受眾群體。要加快節(jié)目的更新?lián)Q代，發(fā)揮優(yōu)勢，打造節(jié)目品牌，立足眼前，放眼社會現(xiàn)象，結(jié)合當代形式，結(jié)合各個社交平臺，例如微博、豆瓣、知乎等新媒體，在其中尋找大眾接受并喜愛的節(jié)目題材，不能一味地選擇抄襲優(yōu)秀節(jié)目，獲取流量，要做有想法、有創(chuàng)新、有責(zé)任感的新節(jié)目，為大眾帶來優(yōu)良的電視節(jié)目的同時傳播正確的價值觀與人生觀。?

1.9 TUNEL法檢測血管平滑肌細胞凋亡情況

小鼠血管鈣化時，BI-1和OPA1蛋白表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=0.0044）。而過表達BI-1蛋白促進OPA1蛋白表達（=0.0142，圖1）。為進一步驗證BI-1和OPA1的相互作用關(guān)系，我們建立了血管平滑肌細胞鈣化模型，結(jié)果顯示β-GP和氯化鈣能降低血管平滑肌細胞BI-1和OPA1蛋白，而上調(diào)BI-1蛋白能增加OPA1蛋白表達（圖2）。

1.10 Western blot法檢測主動脈組織BI-1、OPA1蛋白的表達水平

將平滑肌特異性表達Cre 酶的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠（Tagln-cre）與雌性O(shè)PA1小鼠交配，通過繁殖篩選，得到Tagln-cre；OPA1轉(zhuǎn)基因小鼠，并與BI-1；ApoE小鼠交配繁殖，并篩選出BI-1；OPA1；ApoE轉(zhuǎn)基因小鼠，通過Western blot鑒定OPA1敲低的程度與特異性。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

構(gòu)建血管平滑肌特異性蛋白SM22α啟動子與BI-1位點突變體真核表達質(zhì)粒，通過顯微注射受精卵的方法制備目標小鼠，經(jīng)過Western blot法證明BI-1在小鼠血管平滑肌細胞特異性高表達。將BI-1轉(zhuǎn)基因小鼠與ApoE小鼠多次雜交并做基因鑒定之后，得到基因型為BI-1；ApoE小鼠用于試驗。

取主動脈組織放入鹽酸中過夜，次日取上清液進行鈣含量測定，使用酶標儀檢測吸光度，計算出鈣含量（mg/g）。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、血糖、血脂比較

與Control 組比較，VC 組、VC+BI-1組和VC+BI-1+OPA1組體質(zhì)量、血糖、血膽固醇、血甘油三酯均升高（＜0.001）。與VC組比較，VC+BI-1組和VC+BI-1+OPA1組體質(zhì)量、血糖、血膽固醇、血甘油三酯差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，表1）。

2.2 小鼠血管鈣化后BI-1和OPA1的蛋白表達

取血管平滑肌細胞建立鈣化模型，使用多聚甲醛固定細胞，使用TUNEL試劑盒測定細胞凋亡，每樣本中加入50 μL 標記液，常溫下培養(yǎng)60 min，然后加入辣根過氧化物培育30 min，PBS沖洗后，加入顯色劑，細胞核染成棕色提示細胞凋亡，顯微鏡下計數(shù)并記錄。

這筆專用基金的宣傳面臨著一個棘手的問題。在治療阿爾茨海默病方面，唯一通過審批的藥物不能阻止神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，只能治療該病的癥狀，而且治療效果也不太好。在過去一年中，基于該領(lǐng)域一些假設(shè)（如降低遍布于阿爾茨海默病患者大腦的β-淀粉樣斑塊水平將會阻止該病的發(fā)展等）的幾項主要的臨床試驗都失敗了。最近，一種靶向攻擊β-淀粉樣斑塊的抗體在第二階段試驗中呈現(xiàn)出較好的結(jié)果。然而，鑒于過去那些受到密切關(guān)注的化合物所遭到的失敗，許多研究人員仍然對此持有懷疑態(tài)度，并希望看到更大規(guī)模的第三階段試驗。

2.3 BI-1/OPA1蛋白通路對小鼠血管鈣化鈣沉積和斑塊面積的影響

von Kossa染色結(jié)果顯示，血管鈣化后鈣鹽沉積明顯增多，過表達BI-1蛋白后鈣鹽沉積減少（=0.0006），沉默OPA1蛋白后鈣鹽沉積再次增加（=0.0007，圖3）。過表達BI-1蛋白不僅能減少鈣化面積，還能減少斑塊面積，而沉默OPA1 蛋白后斑塊面積增多（=0.0013，圖4）。血管鈣化后鈣含量增加，過表達BI-1蛋白能降低鈣含量，而沉默OPA1蛋白后鈣含量再次增高（＜0.001，圖5）。

2.4 BI-1/OPA1 蛋白通路對小鼠血管鈣化Runx-2 和BMP-2表達的影響

免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示，血管鈣化后Runx-2 和BMP-2 表達增加，過表達BI-1 蛋白后Runx-2和BMP-2表達下降，而沉默OPA1蛋白后Runx-2（=0.0008）和BMP-2 表達恢復(fù)到鈣化時水平（=0.0045，圖6～8）。

2.5 BI-1/OPA1 蛋白通路對小鼠血管鈣化活化的caspase-3表達的影響

血管鈣化后活化的caspase-3表達增加，過表達BI-1蛋白后活化的caspase-3蛋白表達減少；而沉默OPA1蛋白后活化的caspase-3 蛋白表達再次增多（=0.0054，圖9）。為進一步證實BI-1/OPA1蛋白通路對細胞凋亡的作用，我們建立了血管平滑肌細胞鈣化模型，結(jié)果顯示過表達BI-1蛋白明顯抑制血管平滑肌細胞凋亡，而沉默OPA1 蛋白后細胞凋亡又恢復(fù)到鈣化時水平（=0.0002，圖10）。

3 討論

血管鈣化在糖尿病血管病變、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病中非常常見，是心血管急癥的重要危險因子。血管鈣化分為兩類：一類是發(fā)生在內(nèi)膜的動脈粥樣硬化鈣化，另一類是發(fā)生在中膜的慢行腎臟疾病或者糖尿病腎病的鈣化。血管鈣化的機制十分復(fù)雜，目前認為多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)的主動過程，類似于骨發(fā)育過程。其機制學(xué)說主要包括：血管平滑肌細胞成骨型分化學(xué)說、鈣或磷酸鹽穩(wěn)態(tài)失常、細胞凋亡、炎癥等。有學(xué)者提出BI-1在冠狀動脈粥樣硬化心臟病中發(fā)揮一定作用，BI-1可以抑制心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡和結(jié)構(gòu)破壞，進而減輕缺血再灌注引起的心臟損傷。有研究結(jié)果提示過表達BI-1能減少心腎綜合征引起的心肌細胞凋亡和心臟的損害。最近研究表明BI-1是抗血管平滑肌細胞鈣化的關(guān)鍵分子。本研究通過構(gòu)建小鼠血管鈣化模型，發(fā)現(xiàn)血管鈣化后，BI-1蛋白表達明顯下降，血管組織鈣含量、Runx-2、BMP-2和活化的caspase-3蛋白表達增加，而過表達BI-1蛋白能降低細胞鈣含量、Runx-2、BMP-2和活化的caspase-3蛋白表達，進而減輕血管鈣化。本研究從動物試驗方面進一步證實了BI-1通過抑制細胞凋亡和細胞骨型分化發(fā)揮對血管的保護作用。

血管鈣化時，激活線粒體融合/自噬能起到減輕血管鈣化的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化時，OPA1表達減少，而促進OPA1表達能減少線粒體分裂，促進線粒體融合和自噬，保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整，減少氧化應(yīng)激損傷等，進而減輕血管鈣化。有研究發(fā)現(xiàn)BI-1能保護腎小管上皮細胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，減少線粒體氧化應(yīng)激，促進線粒體呼吸功能，抑制線粒體分裂和線粒體凋亡，進而減輕急性腎損傷。有研究發(fā)現(xiàn)BI-1蛋白能抑制心肌缺血再灌注損傷時線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少線粒體分裂和線粒體損傷引起的細胞凋亡。但是血管鈣化時BI-1是如何調(diào)控線粒體融合蛋白OPA1的，BI-1是否通過OPA1影響血管鈣化，還有待于進一步明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管鈣化后BI-1失活抑制OPA1蛋白表達，過表達BI-1蛋白后OPA1蛋白表達增加，結(jié)果提示BI-1可以調(diào)控OPA1的表達。另外我們進一步發(fā)現(xiàn)過表達BI-1能抑制鈣沉積、細胞骨型分化和細胞凋亡，而基因敲除OPA1蛋白后，鈣沉積、細胞骨型分化和細胞凋亡指標增加，血管鈣化加重。

綜上所述，本研究首次探討B(tài)I-1/OPA1通路和血管鈣化的關(guān)系，并進一步驗證了BI-1對OPA1的調(diào)控關(guān)系，結(jié)果提示血管鈣化可以抑制BI-1，減少OPA1表達；而促進BI-1蛋白表達，能激活OPA1表達，減輕血管鈣化。相信隨著研究的深入，將來一定為血管鈣化診斷和治療開辟新的方法和途徑。本研究局限性在于缺乏更深入的機制研究，比如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體自噬等；另外缺乏BI-1；ApoE小鼠組、BI-1；OPA1；ApoE小鼠組作為對照，有待進一步研究。