唐氏綜合征（DS）是最常見(jiàn)的染色體非整倍體，發(fā)病率約為1∶700活產(chǎn)。該綜合征包括80多種影響所有主要器官的臨床表現(xiàn)，以及不同程度的認(rèn)知功能障礙和顱面異常，這是唐氏綜合征患者最常見(jiàn)的臨床特征。同時(shí)，唐氏綜合征常伴發(fā)生先天性心臟缺陷、胃腸道異常、兒童白血病或早發(fā)性阿爾茨海默病等。唐氏綜合征的表型可能是基因失衡所引起，由于21號(hào)染色體基因劑量增加了50%且存在與其他基因相互不平衡的作用。目前，唐氏綜合征在臨床缺乏治療的有效手段，主要通過(guò)產(chǎn)前篩查和診斷的方式減少唐氏患兒的出生。

目前常用于唐氏兒的篩查方法是一種聯(lián)合檢測(cè)，包括從母體血液中提取的幾種生化標(biāo)記物和胎兒超聲標(biāo)記物，但檢出率僅60%～70%。無(wú)創(chuàng)胎兒DNA檢查對(duì)于唐氏綜合征檢出率較高，但檢查費(fèi)用高，技術(shù)操作復(fù)雜，檢查周期長(zhǎng)，不易在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣。篩查的陽(yáng)性結(jié)果需要通過(guò)侵入性產(chǎn)前診斷檢測(cè)絨毛膜絨毛取樣（CVS）或羊膜穿刺術(shù)來(lái)確認(rèn)。然而，這兩種手術(shù)對(duì)操作者的臨床經(jīng)驗(yàn)要求高，且仍有1%導(dǎo)致流產(chǎn)的機(jī)率。因此，建立一種安全、價(jià)格合理又特異性的唐氏綜合征產(chǎn)前篩查手段仍是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域探索的方向。

miRNA是真核生物中常見(jiàn)的一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。繼妊娠者血漿中胎兒游離DNA被發(fā)現(xiàn)后，有文獻(xiàn)報(bào)道母體外周血中還存在胎兒游離RNA。胎盤是胎兒特有的組織，篩出胎盤特異表達(dá)miRNA會(huì)產(chǎn)生新的胎兒特異性標(biāo)志物，對(duì)其檢測(cè)也更具針對(duì)性，可以提高檢測(cè)的特異性和靈敏性，但目前最具特異性的miRNA分子尚有待探討。

本研究重點(diǎn)比較了正常胎盤和唐氏綜合征胎盤中miRNA的表達(dá)；通過(guò)使用陣列技術(shù)對(duì)82個(gè)miRNA全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析；使用生物信息學(xué)工具分析選定的miRNA的靶基因，以繪制潛在的受影響的功能通路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取同期昆明市婦幼保健院產(chǎn)科產(chǎn)前診斷確診唐氏綜合征孕婦（=3，年齡分別為28，35，47歲）及正常對(duì)照孕婦胎盤（=3，年齡分別為29，30，31歲）。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（審批號(hào)：2021-5-7），孕婦均被提供遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2 唐氏綜合征產(chǎn)前診斷的細(xì)胞遺傳學(xué)和高通量測(cè)序分析

使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)μ貉蛩畼颖具M(jìn)行染色體分析。超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)，抽羊水20 mL，離心后棄上清，加入培養(yǎng)基，原位法進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)7～9 d。用GTG顯帶法對(duì)中期染色體進(jìn)行染色，每個(gè)病例檢查30個(gè)分裂像，分析5個(gè)分裂像。采用德國(guó)QIAGEN公司DNeasy Blood and Tissue Kit（69506）試劑盒提取羊水細(xì)胞DNA。采用染色體CNV 檢測(cè)試劑盒（KR0040）進(jìn)行DNA 文庫(kù)構(gòu)建。在Illumina Next-Seq500測(cè)序平臺(tái)對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 標(biāo)本處理

采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較使用Chi-square（N×N）檢驗(yàn)分析，兩組間比較使用-test分析。對(duì)差異表達(dá)基因的篩查以|log2(Foldchange)|＞1且＜0.05為閾值。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

采用高通量測(cè)序技術(shù)。選取唐氏綜合征胎盤和正常胎盤組織各3例，對(duì)子面、母面、絨毛層組織進(jìn)行混樣，充分研磨后TRIzol法提取總RNA。miRNA測(cè)序文庫(kù)制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina）試劑盒。文庫(kù)制備工作完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用Illumina Hiseq2000/2500進(jìn)行測(cè)序。實(shí)驗(yàn)流程按照說(shuō)明書的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行。對(duì)比分析唐氏綜合征胎盤與正常胎盤組織中的差異表達(dá)miRNA，以差異倍數(shù)≥1.5且＜0.05及檢測(cè)豐度較高作為顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)miRBase（https://www.mirbase.org/）查詢目標(biāo)miRNA的序列信息及所在染色體。對(duì)差異表達(dá)miRNA的潛在靶基因進(jìn)行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。

通過(guò)使用miRWalk、Targetscan、miRDB軟件工具對(duì)上調(diào)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并通過(guò)Venny軟件分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA的共同靶基因?yàn)锽TBD3、AUTS2、ALS2等。目前關(guān)于BTBD3的功能在很大程度上是未知的，F(xiàn)agerberg等報(bào)道BTBD3基因特異性在胎盤組織和腦組織中存在高表達(dá)（圖3E）。另有研究發(fā)現(xiàn)，在新生兒發(fā)育過(guò)程中，BTBD3可以將樹(shù)突導(dǎo)向活動(dòng)的軸突終末，并調(diào)節(jié)初級(jí)感覺(jué)皮層中活動(dòng)依賴的樹(shù)突修剪，從而促進(jìn)神經(jīng)回路的形成。在人類和嚙齒類動(dòng)物中，BTBD3在皮層-紋狀體-丘腦-皮層回路中高表達(dá)，包括中背丘腦、前扣帶皮層和海馬體。在這個(gè)回路中，BTBD3的表達(dá)在出生后早期迅速增加，在人類和小鼠中，在兒童和青少年時(shí)期達(dá)到高峰。多篇報(bào)道顯示BTBD3與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。另一靶基因AUST2（自閉癥易感性候選基因2）已成為一個(gè)與廣泛的神經(jīng)心理疾病相關(guān)的關(guān)鍵基因，如自閉癥譜系障礙、智力障礙、精神分裂癥和癲癇。AUTS2位于染色體7q11.22上，該區(qū)域與染色體斷點(diǎn)的易感性相關(guān)。它共跨越1.2 Mb，包括19個(gè)外顯子，其中外顯子1-6位于5'末端，被大內(nèi)含子分開(kāi)，外顯子7-13緊湊排列在基因的3'末端。最初在2002年被報(bào)道為一對(duì)同卵雙胞胎因染色體新發(fā)平衡易位使AUTS2 基因功能被中斷而導(dǎo)致自閉癥。AUTS2已被證明參與多種神經(jīng)發(fā)育過(guò)程：在細(xì)胞核中，它作為神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而在細(xì)胞質(zhì)中，它通過(guò)控制細(xì)胞骨架重排參與大腦皮質(zhì)發(fā)生，包括神經(jīng)元遷移和神經(jīng)發(fā)生。在產(chǎn)后，AUTS2調(diào)節(jié)興奮性突觸的數(shù)量，以維持神經(jīng)回路中興奮和抑制之間的平衡。在本次唐氏綜合征胎盤組織轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序中顯示AUST2、BTBD3 和ALS2 轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)下調(diào)。在AUST2與BTBD3均參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育，鑒于唐氏綜合征患兒均存在智力障礙的問(wèn)題，其是否與BTBD3、AUST2基因表達(dá)下調(diào)相關(guān)是我們下一步將繼續(xù)研究的方向。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

胎盤娩出后2 h內(nèi)完成組織采樣。以臍帶附著點(diǎn)為中心，在對(duì)稱的四個(gè)方位（ABCD），子面、母面、絨毛層分別取1 cm樣本，放入含RNA-later 試劑的EP 管中4 ℃過(guò)夜，后置于液氮中速凍，之后置于-80 ℃冰箱保存。

2 結(jié)果

2.1 唐氏綜合征產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

已有研究顯示，通過(guò)檢測(cè)母體外周血中胎兒游離RNA，可將唐氏綜合征診斷的敏感度和特異性分別提高至90.0%和96.5%。胎兒來(lái)源的游離RNA在母體外周血中以亞細(xì)胞小體形式存在，不易被RNA酶降解，且在妊娠期母體血液中含量豐富，有望成為無(wú)創(chuàng)途徑獲得胎兒遺傳物質(zhì)的另一個(gè)候選標(biāo)記物。近年來(lái)孕婦血液特異的miRNA檢測(cè)有望成為一種新型的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)手段逐漸受到重視。Karaca等對(duì)懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦的羊水miRNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)21號(hào)染色體相關(guān)性miRNA-125b-2，miRNA-155 和miRNA-3156 在懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦羊水中明顯高于正常妊娠或未妊娠女性。我們的檢測(cè)結(jié)果（表1）中顯示miR-125b-2-3p在唐氏綜合征胎盤中的表達(dá)量高于正常胎盤，與報(bào)道一致。

她笑后又接著說(shuō)：“你們男人啊，是不是一看見(jiàn)好看的女人，就像老貓子嗅到腥一樣，就是不要了老命，也恨不得一口把她含在嘴里才過(guò)得？”

2.2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及質(zhì)量分析

通過(guò)對(duì)所有差異表達(dá)miRNA 的靶基因GO 和Pathway分析發(fā)現(xiàn)，GO富集分析結(jié)果表明，生物過(guò)程模塊多數(shù)為參與RNA代謝過(guò)程及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其余與感覺(jué)器官發(fā)育、眼睛發(fā)育等相關(guān)，RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控推測(cè)與唐氏綜合征患兒各類代謝產(chǎn)物異常表達(dá)有關(guān)。參與的細(xì)胞組分方面，多數(shù)富集在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)相關(guān)組分，其余在整個(gè)細(xì)胞器、細(xì)胞核均有涉及。分子功能近年成為在腫瘤、代謝病及遺傳病的研究重點(diǎn)，在本文中，唐氏綜合征的分子功能富集主要顯示在蛋白質(zhì)結(jié)合和金屬離子結(jié)合方面，且在各類酶活性中均有富集。研究報(bào)道在唐氏綜合征中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的代謝途徑發(fā)生了改變：通過(guò)水解酶、金屬蛋白酶等降低神經(jīng)生長(zhǎng)因子的數(shù)量。其余富集到轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程等。

2.3 唐氏綜合征胎盤中miRNA差異表達(dá)情況

通過(guò)對(duì)所有差異表達(dá)miRNA 的靶基因GO 和Pathway分析發(fā)現(xiàn)，GO富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要參與的分子功能包括蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、核苷酸結(jié)合、DNA結(jié)合、水解酶活性、ATP結(jié)合、RNA結(jié)合、DNA依賴性RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、同種蛋白質(zhì)結(jié)合；參與的細(xì)胞組分包括質(zhì)膜部分、胞質(zhì)部分、細(xì)胞核部分、膜的整體成分、胞質(zhì)部分、核腔、核質(zhì)部分、突觸、細(xì)胞連接、細(xì)胞器、細(xì)胞器腔、膜封閉腔、質(zhì)膜部分、核仁、突觸部分、細(xì)胞內(nèi)非膜細(xì)胞器、非膜細(xì)胞器、核外圍、核基質(zhì)；參與的生物過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA 代謝過(guò)程調(diào)控、DNA 依賴性RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、眼睛發(fā)育、感覺(jué)器官發(fā)育、轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、依賴DNA、磷酸化、磷代謝過(guò)程、磷酸鹽代謝過(guò)程、mRNA代謝過(guò)程。KEGG富集分析結(jié)果表明差異表達(dá)miRNA靶基因主要參與的信號(hào)通路包括腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、細(xì)胞骨架調(diào)控信號(hào)通路、嘌呤代謝相關(guān)信號(hào)通路、P53相關(guān)信號(hào)通路（圖4）。

2.4 差異表達(dá)miRNA的靶基因功能富集分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)篩選出82個(gè)差異表達(dá)的miRNA。與正常胎盤組織相比，唐氏綜合征胎盤組織中有29個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)（變化倍數(shù)≥2，＜0.05），15個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（變化倍數(shù)≥2，＜0.05）；根據(jù)表達(dá)豐度（表達(dá)豐度300以上）共篩選出4個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA，6個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA。差異表達(dá)的miRNA分布在不同的染色體上，其中包括一個(gè)21號(hào)染色體衍生的miRNA（表1）。差異表達(dá)miRNA的火山圖、整體層次聚類圖顯示這些miRNA在兩組中表達(dá)有顯著差異（圖3A～C）。通過(guò)miRWalk、Targetscan、miRDB軟件預(yù)測(cè)靶基因后進(jìn)行分析，miRNA-323a-3p、miRNA-199b-5p 和miRNA-125b-2-3p 共同靶基因?yàn)锳LS2（鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子）。miRNA-323a-3p 和miRNA-199b-5p 共同靶基因?yàn)锽TBD3、AUTS2等（圖3D）。對(duì)95個(gè)人的組織樣本進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，靶基因BTBD3在27個(gè)不同組織中的表達(dá)情況（圖3E，數(shù)據(jù)來(lái)自Bioproject：PRJEB4337。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/22903/）。

3 討論

唐氏綜合征的發(fā)生與母親的懷孕年齡有關(guān)，高齡孕婦唐氏綜合征患兒的發(fā)病率更高，卵子老化也與唐氏綜合征的發(fā)生有著不可分離的關(guān)系。據(jù)報(bào)道，30歲以下的孕婦孕育唐氏綜合征胎兒風(fēng)險(xiǎn)為1/1000，35歲以上孕婦風(fēng)險(xiǎn)率1/270，40歲以上孕婦風(fēng)險(xiǎn)率為1/100，45歲以上孕婦風(fēng)險(xiǎn)率為1/20。95%左右的唐氏綜合征患者父母均為正常且家族中也沒(méi)有唐氏綜合征，其發(fā)生是受精卵早期細(xì)胞分裂錯(cuò)誤或生殖細(xì)胞（精子或卵子）分裂錯(cuò)誤導(dǎo)致的。僅有5%以下的唐氏綜合征的發(fā)生與父母染色體結(jié)構(gòu)異常（如易位）有關(guān)。所以理論上講，不管是否有家族史，所有懷孕的人都應(yīng)該進(jìn)行唐氏篩查，提高孕婦及家屬對(duì)于唐氏綜合征系列產(chǎn)前篩查的重視程度，使更多孕婦主動(dòng)接受唐氏綜合征系列產(chǎn)前篩查，進(jìn)行唐氏綜合征患兒的早期診斷，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

唐氏綜合征病例產(chǎn)前診斷羊水細(xì)胞染色體核型和高通量測(cè)序結(jié)果一致，均為21三體（圖1）。

截止至2018年5月31日，“體育舞蹈圈”公眾號(hào)粉絲已達(dá)到238 805人，并覆蓋全國(guó)包括臺(tái)灣在內(nèi)的34個(gè)省、市、自治區(qū)、直轄市，目前粉絲數(shù)量仍處于健康增長(zhǎng)狀態(tài)。此外，根據(jù)線上問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果顯示，如表1，“體育舞蹈圈”微信公眾號(hào)粉絲群體大致可分為體育舞蹈初學(xué)者、等級(jí)考試參與者、體育舞蹈在職教師三類群體，且三者需求均以學(xué)習(xí)體育舞蹈教材及配套等級(jí)組合視頻為主。

測(cè)序結(jié)果經(jīng)base calling軟件CASAVA分析后Q值（堿基質(zhì)量值）顯示由于測(cè)序一起造成的某個(gè)位置堿基錯(cuò)誤率小于1%，測(cè)序質(zhì)量可靠。在樣本間重復(fù)性分析中使用Pearson相關(guān)性分析、PCA分析（主成分分析）來(lái)判斷，顯示數(shù)據(jù)可信度良好（圖2）。

平順縣隸屬于山西省東南部的長(zhǎng)治市，位于太行山西側(cè)，黃土高原東部邊緣，處于我國(guó)由華北平原向第二階梯過(guò)度的前沿，平均海拔高于1000m的地區(qū)占全縣總面積的70%以上（圖1）。全縣地勢(shì)南高北低、自東南向西北傾斜。境內(nèi)河流則有濁漳河，東部的虹霓河、南部宑底河系集東南部山地雨水形成，流域面積均較小[10]?？h境內(nèi)地貌以山地為主，平原僅在濁漳河兩岸有少量分布[11]。

在本次分析結(jié)果中，KEGG富集分析結(jié)果表明差異表達(dá)miRNA靶基因主要參與的信號(hào)通路有腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。PI3K-Akt信號(hào)通路作為腦組織受體，推測(cè)其在唐氏綜合征患兒腦發(fā)育過(guò)程起到重要作用。近年來(lái)，關(guān)于唐氏綜合征生物標(biāo)記物及發(fā)病的分子機(jī)制已有一定研究，但尚缺乏更多臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，本次的檢測(cè)可能為唐氏綜合征發(fā)病的分子機(jī)制提供了新論據(jù)。

工業(yè)革命之前，技術(shù)進(jìn)步非常緩慢，一個(gè)人一生幾乎感受不到技術(shù)的進(jìn)步，沿著同樣的技術(shù)路徑勞動(dòng)和生活，可謂天經(jīng)地義。工業(yè)革命以后，尤其是20世紀(jì)下半葉以來(lái)，一個(gè)人可以感受到技術(shù)的明顯進(jìn)步。1980年代以來(lái)，每十年甚至每年都可以感受到技術(shù)的明顯進(jìn)步。

本研究所納入的臨床試驗(yàn)普遍質(zhì)量較低，缺乏高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的RCT。由于各研究間針刺所選穴位不同、服用的西藥和中成藥不同，且各研究間所納入患者的病情嚴(yán)重程度不一等因素的影響，造成分析過(guò)程中各研究間存在較大異質(zhì)性。在治療前后NIH-CPSI評(píng)分變化量與白細(xì)胞降低有效率作為結(jié)局指標(biāo)的分析中，由于納入的相關(guān)分析較少，得出的結(jié)果可能可靠性不強(qiáng)。故在今后要多進(jìn)行相關(guān)的臨床研究，尤其是與中藥湯劑、中藥坐浴和微波治療等方面的對(duì)比研究，且要進(jìn)行高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的RCT；盡量多注重治療后隨訪的結(jié)果，為針刺治療CP遠(yuǎn)期療效提供可靠證據(jù)。

綜上所述，可能提示miRNA的過(guò)度表達(dá)屬于影響胎盤形成模式及對(duì)胎兒發(fā)育的所有后果的重要因素。唐氏胎兒在早期發(fā)育時(shí)胎盤組織中miRNA表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，進(jìn)而抑制胎兒神經(jīng)發(fā)育相關(guān)靶基因的表達(dá)。我們下一步進(jìn)行血清學(xué)驗(yàn)證miRNA表達(dá)情況，可用于彌補(bǔ)血清學(xué)篩查在唐氏綜合征篩查的特異性不足的問(wèn)題，提高孕早期唐氏綜合征篩查的準(zhǔn)確性。