包英華 ，蘇慧玲，陳永浩，馮藝飛，嚴(yán)基銀，張自斌

（1.韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005； 2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，廣西 南寧 530007）

鼓槌石斛（Dendrobiun chrysotoxumLindl.），又名金弓石斛、小爪黃草、粗黃草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，以新鮮或干燥莖入藥，是《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）［1］收載的常用中藥材. 鼓槌石斛分布于我國(guó)云南、廣西、四川等省區(qū)［2］，主要含多糖、鼓槌菲、毛蘭素和毛蘭菲等活性成分，其中多糖是鼓槌石斛增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗腫瘤的主要成分之一［3-6］.

由于鼓槌石斛市場(chǎng)需求量增大，野生資源已趨于瀕危，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，為此目前進(jìn)行鼓槌石斛人工培育或栽培研究，但存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，存活率低，生產(chǎn)成本高以及優(yōu)質(zhì)種苗培育、煉苗和移栽技術(shù)尚未成熟等瓶頸問(wèn)題［7-9］，很難達(dá)到預(yù)期目標(biāo). 這些情況說(shuō)明，提高鼓槌石斛多糖的途徑完全依靠野生或栽培藥材是行不通的.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，石斛原球莖具有和原植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能［10］，用原球莖合成多糖比細(xì)胞培養(yǎng)合成多糖產(chǎn)量更穩(wěn)定，更容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)［11-13］.

目前，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)與誘導(dǎo)物相結(jié)合方法，提高珍稀瀕危藥用植物組織細(xì)胞代謝產(chǎn)物，已成為普遍關(guān)注的問(wèn)題［14］. 尤其是秋水仙堿作為非生物誘導(dǎo)物，應(yīng)用于多種藥用植物的多倍體培育，已成功獲得了形態(tài)（如莖稈、葉片、果實(shí)、種子、花朵等）加大和增多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂肪）的植物［15-17］. 控溫處理與秋水仙堿結(jié)合使用，更能提高秋水仙堿的誘導(dǎo)作用［18-19］.

本文采用秋水仙堿與控溫處理相結(jié)合的方法，對(duì)鼓槌石斛原球莖進(jìn)行處理，探索秋水仙堿濃度、處理溫度、處理時(shí)間和原球莖培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響，以期為獲得高多糖含量的原球莖培育體系，以及為以原球莖為原料生產(chǎn)鼓槌石斛多糖提供依據(jù).

1 材料與方法

鼓槌石斛采自于云南西雙版納，其種胚在1/2 MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d后，在無(wú)菌條件下，分別浸泡在不同濃度（0、0.1%、0.3%和0.5%）的秋水仙堿溶液中，分別在不同溫度（0、4、8、26 ℃）下進(jìn)行不同時(shí)間（12、24 h）的處理，隨后把原球莖繼代培養(yǎng)在1/2 MS基本培養(yǎng)基上，在溫度為26±2 ℃，光照強(qiáng)度 1 500~2 000 Lx，光照時(shí)間14 h·d-1條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)以不加秋水仙堿、26 ℃處理的為對(duì)照組（CK）.

每隔培養(yǎng)20 d后收取的鼓槌石斛原球莖除去培養(yǎng)基，以瓶為單位（3瓶為一組）稱(chēng)量并記錄原球莖的鮮重；60 ℃烘干并稱(chēng)重，采用《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）法測(cè)定鼓槌石斛原球莖多糖含量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理12 h對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響

從表1可見(jiàn)，秋水仙堿濃度、處理溫度和原球莖培養(yǎng)時(shí)間均對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量均產(chǎn)生影響，而且各處理因素之間差異顯著.

表1 秋水仙堿濃度、溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響（處理時(shí)間：12 h）

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為20 d時(shí)，對(duì)照組和秋水仙堿濃度為0.1%，溫度均為8 ℃的原球莖多糖含量分別可達(dá)23.77%和35.60%；秋水仙堿濃度提高為0.3%（處理溫度為0 ℃）和0.5%（處理溫度為4 ℃）的多糖含量為19.01%和24.42%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為40 d時(shí)，對(duì)照組（處理溫度為4 ℃）的多糖含量可達(dá)15.87%； 秋水仙堿濃度為0.1%和0.5%，處理溫度均為0 ℃時(shí)，多糖含量分別為18.70%和12.85%；秋水仙堿濃度為0.3%（處理溫度為8 ℃）的多糖含量為16.81%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為60 d時(shí)，對(duì)照組和秋水仙堿濃度為0.1%，處理溫度均為8 ℃時(shí)，多糖含量分別可達(dá)20.77%和22.47%； 水仙堿濃度為0.3%和0.5%，處理溫度均為0 ℃時(shí)多糖含量分別為25.31%和12.40%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，對(duì)照組和秋水仙堿濃度為0.1%，處理溫度均為8 ℃時(shí)，多糖含量為22.04%和16.26%； 秋水仙堿濃度為0.3%，處理溫度均為8 ℃時(shí)的多糖含量為23.77%；秋水仙堿濃度為0.5%，處理溫度均為26 ℃時(shí)的多糖含量為14.79%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

分析結(jié)果表明，不同濃度秋水仙堿在不同溫度條件下處理12 h對(duì)提高鼓槌石斛原球莖多糖含量的最佳處理組合為秋水仙堿濃度為0.1%、處理溫度為8 ℃、原球莖培養(yǎng)時(shí)間為20 d，多糖含量可達(dá)35.60%.

2.2 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理24 h對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響

從表2可見(jiàn)，秋水仙堿濃度、處理溫度和原球莖培養(yǎng)時(shí)間均對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量產(chǎn)生影響，而且各處理因素之間差異顯著.

表2 秋水仙堿濃度、溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響（處理時(shí)間：24 h）

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為20 d時(shí)，對(duì)照組在處理溫度為26 ℃和0 ℃時(shí)的多糖含量分別可達(dá)16.94%和17.06%，之間差異無(wú)顯著；秋水仙堿濃度提高為0.1%（處理溫度為26 ℃）、0.3%（處理溫度為4 ℃）和0.5%（處理溫度為8 ℃）時(shí)的多糖含量分別為36.62%、20.78%和16.01%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為40 d時(shí)，對(duì)照組在處理溫度為4℃時(shí)的多糖含量為15.92%；秋水仙堿濃度提高為0.1%（處理溫度為26 ℃）、0.3%（處理溫度為8 ℃）和0.5%（處理溫度為8 ℃）時(shí)的多糖含量分別為23.12%、18.22%和20.43%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為60 d時(shí)，對(duì)照組和秋水仙堿濃度為0.1%和0.3%，處理溫度均在在26 ℃時(shí)的原球莖多糖含量分別可達(dá)15.80%、30.63%、20.77%；秋水仙堿濃度為0.5%，處理溫度為8 ℃時(shí)的多糖含量為13.81%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，對(duì)照組和秋水仙堿濃度為0.1%，處理溫度為26 ℃時(shí)的多糖含量分別為15.07%、24.45%；秋水仙堿濃度為0.3%和0.5%，處理溫度為8 ℃時(shí)的多糖含量分別可達(dá)21.09%和33.82%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

分析結(jié)果表明，不同濃度秋水仙堿在不同溫度條件下處理24 h對(duì)提高鼓槌石斛原球莖多糖含量的最佳處理組合為秋水仙堿濃度為0.1%、處理溫度為26 ℃、原球莖培養(yǎng)時(shí)間為20 d，多糖含量可達(dá)36.62%.

2.3 不同條件下處理12 和24 h對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

從表3和表4可見(jiàn)，秋水仙堿濃度、處理溫度、培養(yǎng)時(shí)間等單因素，培養(yǎng)時(shí)間 * 處理溫度、培養(yǎng)時(shí)間 * 秋水仙堿濃度、處理溫度 * 秋水仙堿濃度等雙因素，以及培養(yǎng)時(shí)間 * 處理溫度 * 秋水仙堿濃度三因素均對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量產(chǎn)生影響；對(duì)應(yīng)的P值均為0.000，表明上述因素與鼓槌石斛原球莖多糖含量之間具有顯著性差異；效應(yīng)檢驗(yàn)的回歸系數(shù)r均為1.000，表明變量間具有很強(qiáng)的正相關(guān)性，影響效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表3 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理12 h對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量影響的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

表4 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理24 h對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖含量影響的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

3 討論

鼓槌石斛原球莖經(jīng)秋水仙堿處理之后，其多糖含量變化差異較大. 研究結(jié)果顯示，原球莖培養(yǎng)時(shí)間為20 d，秋水仙堿濃度為0.1%時(shí)，在8 ℃處理12 h的原球莖多糖含量可達(dá)35.60%、另在26 ℃處理24 h的原球莖多糖含量可達(dá)36.62%，這結(jié)果與滕建北等［20］從鼓槌石斛中提取的多糖含量30.65%相吻合，而且均高于相同條件下對(duì)照組的多糖含量23.77%和16.94%. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，秋水仙堿和控溫處理相結(jié)合使用，對(duì)鼓槌石斛原球莖多糖積累會(huì)產(chǎn)生影響.這一方面可以培育出優(yōu)質(zhì)鼓槌石斛種苗提供條件；另一方面可以為以原球莖替代野生或栽培鼓槌石斛來(lái)生產(chǎn)鼓槌石斛多糖提供依據(jù). 但高多糖含量的鼓槌石斛原球莖，其染色體數(shù)目或植物形態(tài)上是否產(chǎn)生變化、組培苗的移栽成活率如何等等方面需進(jìn)一步深入研究.