尚浩江，周 偉，胡傳明**，申 欣，朱朋昌，李 帥

(1.江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222000；2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇南通 226007；3.上海海洋大學，上海 201306)

條斑紫菜(Neopyropiayezoensis)是我國重要的經濟紅藻，主產于江蘇海區(qū)，此外山東與遼寧海區(qū)也有少量分布。2020-2021生產年度，條斑紫菜育苗面積達8×105m2，海上栽培面積4.1×104hm2，干紫菜產量5.6×109枚(數據由江蘇省紫菜協會提供)，條斑紫菜產業(yè)是我國長江以北人工栽培海藻中最具經濟價值的產業(yè)[1]。長期以來條斑紫菜種苗培育效率滯后于栽培面積的快速發(fā)展，每年均會出現部分地區(qū)種苗供應緊張的情況，導致種苗培育面積無序發(fā)展，育苗面積與栽培面積比逐年增加，育苗企業(yè)虧損面擴大，不利于紫菜產業(yè)的穩(wěn)定。紫菜的種苗培育技術急需向機械化、智能化方向發(fā)展以提高育苗效率，而其中種苗培養(yǎng)基質的篩選，以及突破貝殼基質的制約因素而開發(fā)新型基質，是解決工廠化育苗的關鍵環(huán)節(jié)。

1953-1954年，日本藻類學家黑木宗尚和我國藻類學家曾呈奎幾乎同時完成了甘紫菜(Neopyropiatenera，曾用名Porphyratenera)生活史的研究，為紫菜的人工育苗打下理論基礎[2]，此后曾有自由絲狀體(Free-living conchocelis)采苗[3]、單孢子采苗[4]、紫菜葉狀體細胞酶法采苗[5]等無基質育苗技術出現，均因采苗量達不到生產要求而未被市場接受。目前紫菜種苗產業(yè)仍采用基質培養(yǎng)技術，且貝殼是唯一的培養(yǎng)基質，天然貝殼由95%-99%的碳酸鈣(方解石、文石、球霰石及非晶態(tài))和1%-5%的蛋白質(糖蛋白、多糖、幾丁質和脂質等)構成[6]，種苗以貝殼絲狀體(Shell conchocelis[7])形式生長于貝殼內層。這與貝殼絲狀體的特殊生長方式有關，紫菜果孢子附著于貝殼內層表面，萌發(fā)形成絲狀體后鉆入貝殼生長[8]，而硅藻、藍藻等雜藻不能鉆入貝殼，因此生產培養(yǎng)中可通過簡單的清洗貝殼表面加以純化，從而可以大規(guī)模培養(yǎng)貝殼絲狀體。相反，懸浮培養(yǎng)的自由絲狀體常因雜藻而導致污染難以去除[9]。此外，貝殼絲狀體生長于貝殼內層表面一定深度，受光較為均勻，可以大量同步形成“雙分”，保障了短期內大規(guī)模采苗的要求。

文蛤(Meretrixmeretrix)、牡蠣、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)和扇貝的貝殼是4種廣泛應用的紫菜種苗培養(yǎng)基質，適宜紫菜絲狀體生長且較易獲取[10]。Heo等[11]研究認為牡蠣殼的紫菜絲狀體接種效率高于扇貝殼和文蛤殼。除貝殼外，也有研究表明蛋殼可作為紫菜種苗培養(yǎng)的基質[12]。但目前對紫菜種苗培養(yǎng)技術研究主要聚焦于培養(yǎng)的環(huán)境因子上，如光照強度、光周期與培養(yǎng)水溫等[13-15]，以及黃斑病[16,17]等病害防治方面，未見對貝殼培育性能的系統(tǒng)性研究。因此，本研究選取不同基質材料，如文蛤、近江牡蠣(Ostrearivularis)殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼(Patinopectenyessoensis)殼、海月蛤(Placunaplacenta)殼、雞蛋殼、珍珠等生物合成基質，以及方解石原石、霰石原石、幾丁質碎片與殼聚糖薄膜等與貝殼成分相關的非生物基質，擬通過比較分析，研究多種基質對條斑紫菜貝殼絲狀體著生、生長與殼孢子放散的影響，篩選最適培養(yǎng)基質，為貝殼替代基質的研究打下科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜自由絲狀體取自國家級紫菜種質庫Y-9101品系，文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼由如東華通水產品有限公司提供，海月蛤殼、雞蛋殼、珍珠、方解石原石、霰石原石從市場購買，幾丁質(Lot.G7TDKRJ)由東京化成工業(yè)株式會社生產，高黏度殼聚糖(Lot.C11029612)由上海麥克林生化科技有限公司生產。

1.2 儀器

光照培養(yǎng)箱(MGZ-120B-3，上海丙林電子科技有限公司)；生物顯微鏡[E800，尼康儀器(上海)有限公司]；光譜閃爍照度計(SFIM-300，杭州遠方光電信息股份有限公司)；掃描電子顯微鏡(JSM-6510，日本電子株式會社)。

1.3 方法

1.3.1 絲狀體接種與培養(yǎng)

將文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼、海月蛤殼、雞蛋殼、珍珠、方解石原石和霰石原石清洗干凈，其中雞蛋殼放入有效氯含量5%(m∶V)的84消毒液中浸泡12 h，使雞蛋殼乳突層與蛋殼內側的殼膜層纖維分離[18]，用鑷子將殼膜層清除干凈。殼聚糖加入2%(V∶V)乙酸配置成5%(V∶V)殼聚糖溶液，將5%殼聚糖溶液倒入培養(yǎng)皿自然晾干形成殼聚糖薄膜，沖洗至pH中性。將條斑紫菜自由絲狀體打碎成40-60 μm小段，分別接種于上述培養(yǎng)基質上，接種密度為150 ind./cm2，將每種貝殼各3枚、雞蛋殼碎片3枚(每枚約10 cm2)、珍珠5粒放入培養(yǎng)盒培養(yǎng)，共設置4組平行。將方解石原石、霰石原石各3塊、殼聚糖薄膜3張、碎片狀幾丁質1 g放入培養(yǎng)盒中共同培養(yǎng)，設置培養(yǎng)條件為光照強度(12.5±1.0) μmol/(m2·s)，培養(yǎng)溫度16℃，海水鹽度27‰，光照周期12D∶12L。

1.3.2 著生密度與著生效率的測量

接種后每周用生物顯微鏡觀察絲狀體著生情況，接種6周后貝殼等基質表面藻斑肉眼清晰可見，統(tǒng)計藻斑數量，計算著生密度(著生密度=藻斑數/貝殼面積)，從而計算出著生效率(著生效率=著生密度/接種密度×100%)。

1.3.3 貝殼絲狀體長度的測量

接種2周起通過測量藻斑直徑計算水平生長面積(藻斑近似圓形)，至藻斑生長交連到一起時停止測量。分別于第55天與第100天將貝殼等基質沿著藻斑中心處縱切，采用掃描電鏡測量絲狀體縱向生長長度。

1.3.4 貝殼絲狀體殼孢子放散測量

為了研究不同培養(yǎng)基質中貝殼絲狀體殼孢子的放散水平，接種120 d后，分別取每種貝殼基質各1枚、珍珠5粒、雞蛋殼碎片1枚(約10 cm2)，置于50 mL海水中培養(yǎng)，設置4組平行。培養(yǎng)溫度16℃，光照條件為7:00-12:30光強(31.3±1) μmol/(m2·s)，12:30-18:30光強(6.3±1.0) μmol/(m2·s)，18:30至次日7:00黑暗。連續(xù)20 d測定單位面積培養(yǎng)基質的日放散量[19]，每天中午鏡檢殼孢子放散量后，清洗貝殼并更換海水。通過測量各種基質的接種面積(珍珠接種面積近似半球形)，計算不同基質中殼孢子的日放散效率[殼孢子的日放散效率=殼孢子的日放散量/基質接種面積，spores/(cm2·d)]。

1.3.5 實驗數據處理

各組實驗數據采用GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.，美國)進行處理。數據顯著性分析采用SPSS 22 (IBM，美國)進行單因素方差分析，設置顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 條斑紫菜絲狀體著生情況及其不同培養(yǎng)基質微觀結構

未發(fā)現條斑紫菜絲狀體在方解石原石、霰石原石上著生。幾丁質碎片面積為1-12 mm2，浸入海水后逐漸軟化，表面未發(fā)現絲狀體附著。條斑紫菜絲狀體一端附著于殼聚糖薄膜表面，呈自由絲狀體樣向外生長，并未鉆入薄膜內部，藻絲有少量單側分枝，且分枝處無明顯隆起[圖1(a)]。而條斑紫菜絲狀體著生于文蛤殼等5種貝殼基質以及雞蛋殼和珍珠基質上，并向外生長與向內鉆入生長，其中向外生長呈自由絲狀體樣，與殼聚糖薄膜表面生長的絲狀體無異；向內鉆入基質中，主分枝多于2條，向四周呈輻射生長，側枝多呈對生，且多出現不定形隆起。在貝殼基質和珍珠基質中，條斑紫菜絲狀體著生后先于基質表層生長后鉆入內部[圖1:(b)-(g)]，而在雞蛋殼中，絲狀體著生后即鉆入內部，呈彌散狀[圖1(h)]。

圖1 條斑紫菜貝殼絲狀體著生于不同培養(yǎng)基質的顯微圖

通過掃描電鏡對基質縱切面結構和絲狀體在基質中生長的痕跡進行觀測，三角帆蚌殼、文蛤殼和珍珠外層由排列密集且整齊的細小文石多邊形板片相互疊加構成[圖2:(a)-(d)]。這3種基質剪切時斷裂面整齊。近江牡蠣殼、蝦夷扇貝殼和海月蛤殼由許多細長的菱形方解石板條層層疊加構成，切面在水平方向呈細條狀紋路[圖2:(e)-(f)]，剪切時易產生多層滑動斷裂。條斑紫菜貝殼絲狀體在這6種基質內大多集中在基質的表層，且更容易發(fā)育為孢子囊枝，下層的貝殼絲狀體數量較少，且呈營養(yǎng)藻絲形態(tài)縱向生長。雞蛋殼主要分為兩層結構，分別是蛋殼內側的乳突層和蛋殼外側的柵欄層，乳突層厚度約為100 μm，蛋殼厚度約為300-400 μm [圖2(g)]。兩層結構的表層均分布大量貝殼絲狀體，且藻斑內外發(fā)生重疊，顯示絲狀體穿透蛋殼生長。

圖2 不同條斑紫菜貝殼絲狀體培養(yǎng)基質切面掃描電鏡圖

2.2 不同培養(yǎng)基質中條斑紫菜貝殼絲狀體的著生效率

絲狀體在近江牡蠣殼與雞蛋殼上著生效率最大，分別為(4.5±0.6)%、(4.2±0.6)%(P≥0.05)，其次為蝦夷扇貝殼與三角帆蚌殼，在珍珠基質上的著生效率最低，為(1.7±0.6)%(圖3)。

S：蝦夷扇貝殼;H：三角帆蚌殼;M：近江牡蠣殼;D：雞蛋殼;Z：珍珠;W：文蛤殼;J：海月蛤殼。相同小寫字母表示不同組間差異未達顯著水平(P≥0.05)

2.3 不同培養(yǎng)基質中條斑紫菜貝殼絲狀體的分布

接種兩周后絲狀體開始鉆入基質中并形成貝殼絲狀體。在三角帆蚌、海月蛤、近江牡蠣、蝦夷扇貝和文蛤等貝殼基質中貝殼絲狀體于第4周水平生長速率最快，生長速率均超過1 000 μm/周，第6至第10周水平生長速率較慢，平均生長速率為321-429 μm/周。蛋殼基質中，貝殼絲狀體在第3至第9周的平均水平生長速率為297 μm/周，第10周生長速率最快，達768 μm/周。珍珠基質中，貝殼絲狀體在第3至第8周水平生長速率較慢，平均為317 μm/周，第9周生長速率最快，達736 μm/周。在三角帆蚌殼、近江牡蠣殼和文蛤殼中，貝殼絲狀體前10周的平均水平生長速率為63.5 μm/d (P≥0.05)；其次為蝦夷扇貝殼，為(59.5±10.6) μm/d；雞蛋殼中貝殼絲狀體的水平生長速率最慢，為(39.9±6.9) μm/d(圖4)。

營養(yǎng)藻絲階段，貝殼絲狀體在雞蛋殼中鉆入的深度最深，達(267.4±60.1) μm，其次為三角帆蚌殼與海月蛤殼，分別為(82.1±35.1) μm、(75.9±37.3) μm，而在近江牡蠣殼、蝦夷扇貝殼、文蛤殼以及珍珠中的鉆入深度基本相同(P≥0.05)(圖4)。

第13周，貝殼絲狀體由營養(yǎng)藻絲發(fā)育為孢子囊枝后繼續(xù)生長，孢子囊枝在雞蛋殼中的鉆入深度最深，穿透蛋殼生長，達(334.9±15.0) μm；其次為蝦夷扇貝殼，鉆入深度為(168.5±44.8) μm；孢子囊枝在三角帆蚌殼、海月蛤殼、近江牡蠣殼、文蛤殼和珍珠中的鉆入深度基本一致，為(113.9±27.9) μm(P≥0.05)(圖4)。

S：蝦夷扇貝殼;H：三角帆蚌殼;M：近江牡蠣殼;D：雞蛋殼;Z：珍珠;W：文蛤殼;J：海月蛤殼。相同小寫字母表示不同組間差異未達顯著水平(P≥0.05)

2.4 不同培養(yǎng)基質對條斑紫菜殼孢子放散的影響

貝殼絲狀體殼孢子前6 d平均日放散量均較低，后14 d平均日放散量差異較大，其中文蛤殼基質殼孢子日放散量最大，達624 spores/(cm2·d)，其次為雞蛋殼和海月蛤殼，分別達360 spores/(cm2·d)、223 spores/(cm2·d)，三角帆蚌殼基質殼孢子日放散量最小，為41 spores/(cm2·d) (圖5)。

S：蝦夷扇貝殼；H：三角帆蚌殼；M：近江牡蠣殼；D：雞蛋殼；Z：珍珠；W：文蛤殼；J：海月蛤殼

3 討論

紫菜種苗可采用平鋪或吊掛的方式培養(yǎng)，由于不同貝殼的成分、結構以及質地有差別，導致貝殼絲狀體的生長與殼孢子放散量存在較大的差異。本研究中文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼、海月蛤殼、雞蛋殼和珍珠等7種絲狀體培養(yǎng)基質均為常見的天然材料，主要成分均為碳酸鈣，以及少量幾丁質和蛋白質，貝殼絲狀體在7種基質中的生長及發(fā)育水平差異明顯，可能與培養(yǎng)基質的結構、碳酸鈣結晶方式、晶體排列方式和有機成分等因素有關。Oaki等[20]對雞蛋殼、貝殼珍珠層、海綿骨骼、珊瑚和有孔蟲等5種不同生物礦物材料的納米結構進行研究，發(fā)現其均由納米晶粒聚合形成。從基質的結構及結晶方式來看，文蛤殼和三角帆蚌殼內側的珍珠層均由文石晶體組成[21]；珍珠外側的珍珠層也是由文石晶體組成；蝦夷扇貝殼的內層由文石晶體組成，厚度為250-300 μm[22]；牡蠣殼的內層由方解石晶體形態(tài)構成[23]；雞蛋殼主要分為乳突層和柵欄層，其中的碳酸鈣主要以方解石形態(tài)存在[24]；而海月蛤殼為99%細長的菱形方解石條板構成的單葉微結構。從晶體排列方式來看，Cain等[25]測得雞蛋殼中柵欄層的方解石晶體有著一致的取向性，晶體軸和蛋殼表面的垂直方向有16°-28°的傾斜角度，但是乳突層的晶體取向則是隨機的；蝦夷扇貝殼內層的方解石晶體具有相同的傾斜角度；海月蛤殼具有獨特的透光性，可見光總透射率高達80%，這是因為其每個方解石板條衍射為單晶[26]。本研究中雞蛋殼、蝦夷扇貝殼、近江牡蠣殼和海月蛤殼的培養(yǎng)層為方解石結晶形式，文蛤殼、珍珠和三角帆蚌殼屬于文石結晶形式。絲狀體在這兩種結晶形式的天然基質中均能發(fā)育為貝殼絲狀體。

三角帆蚌、文蛤、牡蠣與蝦夷扇貝的貝殼常用于紫菜育苗產業(yè)，這4種貝殼基質的結構及硬度均有所差異(表1)。本研究顯示，在上述4種貝殼中，貝殼絲狀體在三角帆蚌、文蛤與近江牡蠣的貝殼中水平生長速率高于蝦夷扇貝殼，生長深度低于蝦夷扇貝(P≥0.05)。文蛤殼中孢子放散水平顯著高于其他3種貝殼，三角帆蚌殼最低，因此條斑紫菜殼孢子放散水平不能由水平生長速率和生長深度直接反映，還可能與培養(yǎng)基質的硬度等物理量有關。

表1 紫菜育苗產業(yè)常用貝殼結構及硬度

貝殼因其面積小、內表面不平整的特點，導致紫菜種苗培育過程中清洗、鋪擺工序耗費大量人力與時間，且其易翻覆，降低了采苗效率，因此具有較高平整度與組裝水平的貝殼替代基質是未來紫菜種苗基質發(fā)展的方向。本研究選取了與貝殼內層相同晶體結構的方解石原石、霰石原石，以及與貝殼內層具有共同成分的殼聚糖薄膜、幾丁質碎片進行同步培養(yǎng)，未發(fā)現條斑紫菜絲狀體生長于其中，僅在殼聚糖薄膜表面著生，并向外以自由絲狀體形態(tài)生長，與鉆入生物合成基質的貝殼絲狀體形態(tài)有明顯差異。從生物合成基質的有機成分分析，文蛤殼的有機質成分主要為幾丁質、富含丙氨酸的不可溶蛋白質、富含甘氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的可溶性蛋白等；牡蠣殼中含有幾丁質、糖蛋白、珍珠蛋白、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸和甘氨酸等[34-37]；三角帆蚌殼和珍珠的珍珠層文石結晶間的有機質主要是幾丁質纖維和類絲素蛋白，還含有甘氨酸和丙氨酸等[37]；雞蛋殼中的有機質主要為蛋白質、糖蛋白、蛋白多糖[38]，這些天然生物基質中均含有1%-5%的有機成分[39-43]，因此紫菜絲狀體的著生與貝殼絲狀體的形成可能與基質中的有機成分有關。

4 結論

條斑紫菜絲狀體可在生物合成基質與殼聚糖薄膜表面著生并向外呈自由絲狀體樣生長，向內只在生物合成基質中形成貝殼絲狀體，并發(fā)育至放散殼孢子，未發(fā)現生長于殼聚糖薄膜內，且未在方解石原石、霰石原石與幾丁質碎片內部著生。貝殼絲狀體在近江牡蠣殼與雞蛋殼中著生效率最高，分別達(4.5±0.6)%、(4.2±0.6)%；在三角帆蚌、近江牡蠣和文蛤貝殼中水平生長速率最大，平均為63.5 μm/d(P≥0.05)；在雞蛋殼中縱向生長最深，達(334.9±15.0) μm；在文蛤貝殼中的殼孢子放散量最高，其次為雞蛋殼。因此，除了常用于紫菜育苗生產的文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼與扇貝殼外，雞蛋殼較為適宜貝殼絲狀體的著生、生長與殼孢子放散。