董秀娟，曹若愚，于洪基，竇素棉

(滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061000)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)是育齡期女性常見(jiàn)的婦科疾病之一，發(fā)病率約10%，病程反復(fù)、遷延難愈，是導(dǎo)致痛經(jīng)、盆腔痛甚至不孕的重要原因[1-2]。EMs發(fā)病機(jī)制尚未明確，其中經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)得到普遍認(rèn)可[3]；腹腔為乏氧微環(huán)境，所以適應(yīng)缺氧是內(nèi)膜細(xì)胞種植成功的關(guān)鍵[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是細(xì)胞缺氧適應(yīng)能力最重要的調(diào)控因子，HIF-1α高表達(dá)在EMs發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[5-6]。

大蒜素是由百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等多種藥理學(xué)作用[7-9]，并且能夠通過(guò)下調(diào)HIF-1α表達(dá)對(duì)糖尿病大血管病變起到保護(hù)作用[10]。本研究通過(guò)自體內(nèi)膜移植的方法制備大鼠EMs模型，以孕三烯酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，探討大蒜素對(duì)EMs大鼠異位病灶及HIF-1α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠65只，7周齡，體重170～200 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-004]。分籠飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2019-006]，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%、光照時(shí)間12 h，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 大蒜素膠囊(江蘇正大清江制藥有限公司，批號(hào)：20200324)；孕三烯酮膠囊(北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1911016)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：J20190812)。HE試劑盒(河北博海生物有限公司,批號(hào)：20200104)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005、SEKRT-0401)；兔源HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體和羊抗兔IgG二抗(北京博奧森生物科技有限公司,bs-20399R、bs-1313R、bs-0061R、bs-0295G)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)：SW2030)。

1.3 主要儀器 Vevo2100型小動(dòng)物超聲儀(加拿大Visual Sonics公司)；LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)；HT7700型透射電鏡(日本 Hitachi公司)；Varioskanlux型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；AI09型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；VE180型電泳槽、VE186型轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)；Gel Doc 2000 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 EMs大鼠模型制備：取55只實(shí)驗(yàn)用大鼠，參照文獻(xiàn)[11]自體內(nèi)膜移植法制備EMs大鼠模型：造模前3 d開(kāi)始1次/d灌胃給予戊酸雌二醇(0.1 mg/kg)，以調(diào)節(jié)大鼠動(dòng)情周期使其同時(shí)發(fā)情；腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)實(shí)施麻醉后，于尿道上端約2 cm處開(kāi)腹、暴露左側(cè)子宮，結(jié)扎左側(cè)子宮角并剪取約1 cm長(zhǎng)度的子宮，置0.9%氯化鈉水溶液中并剪成0.5 cm×0.5 cm子宮內(nèi)膜組織塊，將其移植到右側(cè)腹壁皮下筋膜層、腹壁肌層之間，逐層縫合，常規(guī)飼養(yǎng)；假手術(shù)組行模型組相同的手術(shù)通路、結(jié)扎并切除左側(cè)子宮角，但不進(jìn)行自體移植。4周后，通過(guò)小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)，腹壁下方可見(jiàn)暗灰色低回聲區(qū)，即為異位病灶，病灶內(nèi)黑色無(wú)回聲區(qū)則提示病灶內(nèi)有液體，通過(guò)圖像分割測(cè)量異位病灶體積≥50 mm3，則認(rèn)為造模成功。

1.4.2 分組與給藥：取50只模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、孕三烯酮組(陽(yáng)性對(duì)照組)和大蒜素低、中、高劑量組；另10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組。孕三烯酮組灌胃給予0.5 mg/kg的孕三烯酮溶液[12]，大蒜素低、中、高劑量組分別灌胃給予5、10、20 mg/kg的大蒜素溶液(根據(jù)臨床人有效劑量折算大鼠用量，分別為最佳劑量的0.5、1、2倍)，假手術(shù)組和模型組灌胃給予0.9%氯化鈉水溶液，灌胃容量均為5 ml/kg，給藥頻次均為1次/d，療程4周。

1.4.3 異位病灶的外觀檢查及盆腔粘連評(píng)分、病灶體積測(cè)量：末次給藥6 h后，實(shí)施麻醉后開(kāi)腹，用4 ml 0.9%氯化鈉水溶液沖洗腹腔并收集腹腔液，待檢。取假手術(shù)組大鼠在位子宮內(nèi)膜組織及其它組大鼠內(nèi)膜異位病灶，用0.9%氯化鈉水溶液沖洗干凈后，通過(guò)肉眼觀察各組大鼠異位病灶大體外觀及形態(tài)。參照Haber評(píng)分方法進(jìn)行異位病變的盆腔粘連評(píng)分[13]。通過(guò)卡尺測(cè)量異位病灶的長(zhǎng)(mm)、寬(mm)、高(mm)，然后按橢球體積計(jì)算公式計(jì)算病灶體積(Volume，V)，V(mm3)=0.52×長(zhǎng)×寬×高。

1.4.4 HE染色法行子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)檢查：取部分在位(假手術(shù)組)子宮內(nèi)膜組織或內(nèi)膜異位病灶組織，置4%多聚甲醛溶液72 h后，依次進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、5 μm厚度切片、梯度乙醇脫蠟水化后行HE染色，用中性樹(shù)脂封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察在位子宮內(nèi)膜組織組織或內(nèi)膜異位病灶病理學(xué)改變。

1.4.5 透射電子顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：取小塊在位子宮內(nèi)膜組織或內(nèi)膜異位病灶組織，切割成約1 mm×1 mm×1 mm組織塊后依次浸入2.5%戊二醛溶液固定24 h、1%鋨酸溶液固定3 h，沖洗后進(jìn)行梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋后，80 nm厚度超薄切片，經(jīng)鈾鉛雙染色后通過(guò)透射電子顯微鏡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.6 ELISA法檢測(cè)腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量：取“1.4.3”提取的腹腔液，經(jīng)3000 r/min離心10 min后取上清液，然后按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量。

1.4.7 Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)：取每只大鼠約50 mg在位子宮內(nèi)膜組織或內(nèi)膜異位病灶組織，加入4 ℃預(yù)冷裂解液后勻漿，冰上靜置30 min提取總蛋白，4 ℃、12000 r/min離心20 min后取上清液，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，每孔等量上樣后通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，加5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，洗膜后滴加HIF-1α(1∶800)、VEGF(1∶1000)、β-actin(1∶3000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)顯示蛋白條帶，然后以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin(內(nèi)參)條帶灰度值的比值半定量目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶大體外觀的影響 模型組子宮內(nèi)膜異位病灶為內(nèi)含淡黃色液體的囊泡樣結(jié)構(gòu)，形態(tài)飽滿(mǎn)，呈圓形或橢圓形，與盆腔粘連，異位病灶表面可見(jiàn)新生血管生成；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑量組和孕三烯酮組子宮內(nèi)膜異位病灶均明顯縮小，囊內(nèi)液體減少，形態(tài)欠飽滿(mǎn)，外形欠規(guī)則，與盆腔粘連狀況減輕，新生血管減少；大蒜素上述作用呈劑量依賴(lài)性，大蒜素高劑量組效果優(yōu)于其它組。

2.2 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶盆腔粘連評(píng)分和病灶體積的影響 與模型組相比，大蒜素中、高劑量組和孕三烯酮組異位病灶盆腔粘連評(píng)分、病灶體積均顯著降低(P<0.01)；與孕三烯酮組相比，大蒜素高劑量組異位病灶盆腔粘連評(píng)分、病灶體積均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶盆腔粘連評(píng)分和病灶體積的影響

2.3 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)改變的影響 假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜柱狀上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞排列整齊、致密；模型組子宮內(nèi)膜異位病灶柱狀上皮細(xì)胞排列整齊、間質(zhì)細(xì)胞致密、新生血管明顯增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變；大蒜素低、中、高劑量組和孕三烯酮組上皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)疏松、新生血管和炎性細(xì)胞明顯減少，異位內(nèi)膜不同程度剝脫；大蒜素上述作用呈劑量依賴(lài)性，大蒜素高劑量組效果優(yōu)于其他組。見(jiàn)圖1。

圖1 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)改變的影響(HE染色，×200)

2.4 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響 假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞核膜完整、核仁清晰、線粒體結(jié)構(gòu)正常；與假手術(shù)組相比，模型組子宮內(nèi)膜異位病灶上皮細(xì)胞核膜完整、核仁清晰，線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常但數(shù)量明顯增多；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑量組和孕三烯酮組子宮內(nèi)膜異位病灶上皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)疏松、新生血管和炎性細(xì)胞明顯減少，線粒體呈現(xiàn)腫脹、脊斷裂溶解、脊間隙增大等超微結(jié)構(gòu)改變；其中大蒜素高劑量組上述效果優(yōu)于其它組。見(jiàn)圖2。

圖2 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響(透射電子顯微鏡，×7000)

2.5 大蒜素對(duì)EMs大鼠腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β1含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素中、高劑量組和孕三烯酮組TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β1含量均顯著降低(P<0.01)；與孕三烯酮組相比，大蒜素高劑量組TNF-α、IL-6、TGF-β1含量均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大蒜素對(duì)EMs大鼠腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量的影響(ng/L)

2.6 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組在位子宮內(nèi)膜相比，模型組子宮內(nèi)膜異位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑量組子宮內(nèi)膜異位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與孕三烯酮組相比，中、高劑量大蒜素組子宮內(nèi)膜異位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表3。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：大蒜素低劑量組；D：大蒜素中劑量組；E：大蒜素高劑量組；F：孕三烯酮組圖3 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的影響

表3 大蒜素對(duì)EMs大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

EMs是最常見(jiàn)的婦科疾病之一，與育齡期女性50%的不孕癥及80%的痛經(jīng)有關(guān)，并且EMs作為一種良性疾病，卻具有惡性腫瘤般侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，給女性造成極大的生理和心理負(fù)擔(dān)[14]。EMs病理機(jī)制復(fù)雜，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)乏氧在EMs疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，為EMs新型治療藥物研究提供了有效靶點(diǎn)。

在中醫(yī)EMs屬“痛經(jīng)”“癥瘕”“月經(jīng)病”“不孕”等范疇，瘀血阻滯、氣血運(yùn)行不暢是EMs的重要病理機(jī)制。大蒜為百合科蔥屬植物，其鱗莖可入藥，性溫、味辛甘，大蒜素是其主要活性成分，具有活血化瘀、益氣解毒、宣通溫補(bǔ)之功效[15]。孕三烯酮是臨床治療EMs的常用藥物，能夠通過(guò)對(duì)抗雌激素而抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的生長(zhǎng)。大鼠具有飼養(yǎng)成本低、動(dòng)情周期短、自發(fā)排卵等特點(diǎn)，移植造模法主要分為自體、同種異體、異種異體移植法，其中自體移植法具有與人體EMs病理特點(diǎn)接近、異位灶種植部位準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)[16]。本研究采用自體移植法制備EMs大鼠模型，以孕三烯酮為陽(yáng)性對(duì)照藥物，結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療后異位病灶明顯縮小，粘連評(píng)分降低，異位病灶上皮細(xì)胞呈現(xiàn)脫落、間質(zhì)疏松且新生血管明顯減少，上皮細(xì)胞線粒體數(shù)量明顯減少且呈現(xiàn)腫脹、脊斷裂溶解、脊間隙增大等超微結(jié)構(gòu)改變，腹腔液中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量和TGF-β1含量明顯降低，并且大蒜素高劑量組降低異位病灶體積、降低粘連評(píng)分、誘導(dǎo)異位病灶及其上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的作用優(yōu)于孕三烯酮組，提示大蒜素對(duì)EMs大鼠異位病灶生長(zhǎng)及炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

EMs的發(fā)生進(jìn)展與腹腔內(nèi)乏氧微環(huán)境狀態(tài)的適應(yīng)性密切相關(guān)[17]。HIF-1是調(diào)控細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)控因子，HIF-1是由HIF-1α、HIF-1β兩種亞基形成的二聚體，其中HIF-1α為氧敏感型，在常氧下?tīng)顟B(tài)下能夠被泛素-蛋白酶系統(tǒng)迅速降解，乏氧則阻斷泛素-蛋白酶系統(tǒng)而抑制HIF-1α降解，HIF-1α能夠調(diào)控一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而提高細(xì)胞對(duì)乏氧的適應(yīng)能力[18]。因此，HIF-1活性主要依賴(lài)于HIF-1α亞基。VEGF為HIF-1α靶基因，是促進(jìn)血管生成的強(qiáng)刺激因子[19]。此外，HIF-1α具有穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)與功能的作用，可能與HIF-1α調(diào)控鈣離子濃度、抑制氧自由基生成等有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，EMs模型大鼠異位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與祁建青等研究結(jié)果基本一致；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療后異位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。

綜上所述，大蒜素對(duì)EMs大鼠異位病灶生長(zhǎng)具有抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)HIF-1α表達(dá)，抑制異位病灶血管新生、誘導(dǎo)線粒體損傷有關(guān)，但HIF-1α對(duì)線粒體的調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。