基于二維液相色譜體系分析特殊醫(yī)學用途奶粉中的?；撬岷?/h1>
2022-04-12 03:29:36翁史昱
中國食品學報 2022年3期
卞 華，翁史昱，王 亮
（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院 上海 200233）
牛磺酸（Taurine，C2H7NO3S，HO3S-CH2-CH2-NH2）化學名為β-氨基乙磺酸，是一種特殊的含硫非蛋白氨基酸，以游離狀態(tài)分布于組織間液和細胞內(nèi)液中。?；撬峋哂型怀龅纳硭幚碜饔茫苷{(diào)節(jié)機體內(nèi)糖類和脂類的代謝，提高機體免疫力，維持滲透壓平衡，增強細胞膜抗氧化能力等[1-3]，對嬰幼兒智力開發(fā)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也有重要作用[4-5]。目前，牛磺酸作為一種必備的營養(yǎng)強化劑添加在食品中，歐美等發(fā)達國家規(guī)定在嬰幼兒食品中必須添加一定量的牛磺酸。我國食品安全國家標準也規(guī)定，為了改善嬰幼兒配方食品的蛋白質(zhì)質(zhì)量，提高其營養(yǎng)價值，推薦嬰兒配方乳制品中添加適當牛磺酸。
特殊醫(yī)學用途配方奶粉（特醫(yī)奶粉） 主要包括：部分水解、深度水解和全氨基酸水解配方奶粉，是針對過敏體質(zhì)嬰兒專門設計的。嬰幼兒的免疫系統(tǒng)未完全發(fā)育，胃腸道屏障發(fā)育不成熟，牛奶蛋白對嬰幼兒來說是一種異種蛋白，牛奶中的β-乳球蛋白有很強的致敏性，極易出現(xiàn)嬰幼兒牛奶蛋白過敏，造成便血，腹脹，甚至會導致患兒出現(xiàn)死亡以及過敏性休克[6]。牛奶蛋白過敏的發(fā)病率為6%，已成為對嬰幼兒健康成長發(fā)育產(chǎn)生影響的首要因素[7-8]。水解配方奶粉在加工時將牛奶中的蛋白質(zhì)部分水解或者完全水解，以降低過敏概率，且不會影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)，已成為大多嬰幼兒食用的首選。
特醫(yī)奶粉的基質(zhì)體系相對于普通嬰兒配方奶粉復雜很多，蛋白質(zhì)被水解后形成大量的氨基酸于基質(zhì)中，對于牛磺酸的定量分析會產(chǎn)生很大的干擾。其中，薄層掃描法[9-10]很容易受到其余氨基酸的干擾，準確性較低；高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]雖應用廣泛，但對于奶粉本身的基質(zhì)效應顯著，重復性不理想；高效液相色譜——紫外檢測[14-16]，受到?；撬嶙陨碜贤馕蛰^弱的影響，靈敏度較低。
本文選擇基質(zhì)最為復雜的全氨基酸水解配方奶粉，改進前處理方法，以克服反應時間長的缺點[17]，保留丹磺酰氯柱前衍生定量準確的優(yōu)點，并構建二維液相系統(tǒng)（2D-LC）。在除去大量氨基酸的干擾后，利用熒光檢測器精確測定?；撬岷?。本試驗方法，不僅解決了國家標準目前無法準確定量全氨基酸水解配方奶粉中?；撬岷康膯栴}，對其余特殊醫(yī)學用途奶粉和普通嬰幼兒配方奶粉也同樣適用。
1 材料與方法
1.1 設備和試劑
DionexUltiMate 3000 系統(tǒng) （雙三元梯度泵），美國 Thermal Scientific；Centrifuge 5804 高速離心機，德國 Eppendorf；D-91126 多管渦旋振蕩器，德國Heidolph；C9NK-SK1200BTU 超聲波清洗機，中國KUDOS；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millipore；MSZO 204S 型電子天平，瑞士Mettler Toledo。
?；撬針藴势?、?；撬釋嵨飿藰樱袊鴻z驗檢疫科學研究院測試評估中心；嬰幼兒配方奶粉、特殊醫(yī)學用途水解配方奶粉，國內(nèi)某知名乳業(yè)有限公司；丹磺酰氯，日本東京化成工業(yè)株式公社；甲醇、乙腈（色譜純），美國Thermal Fisher Chemical；甲酸（色譜純），美國ACS 色譜試劑；三乙胺（色譜純），美國Tedia；三氟乙酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。
1.2 試驗方法
1.2.1 標準溶液和衍生溶液配制 精確稱取?；撬針藴势?00.0 mg 于100 mL 容量瓶，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液。試驗前，將儲備液用水稀釋成質(zhì)量濃度為1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/mL 的標準工作液進行衍生，由高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）檢測，以保留時間定性，外標法定量。
1.2.2 樣品前處理 提?。壕_稱?。?.00±0.05）g 奶粉樣品于50 mL 聚四氟乙烯塑料離心管中，加入約35 mL 超純水，渦旋5 min，超聲15 min，加入1 mL 150 g/L 亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 300 g/L 乙酸鋅溶液，去除基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，以9 000 r/min 離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度。
衍生：取1 mL 溶液于10 mL 聚四氟乙烯塑料離心管中，加入1 mL 30 mg/mL 高質(zhì)量濃度丹磺酰氯衍生液），10 μL 三乙胺，60 ℃避光加熱1 h（每15 min 取出渦旋30 s），加入0.1 mL 質(zhì)量濃度為20 mg/L 的鹽酸甲胺終止反應，過0.22 μm PTFE 濾膜，供2D-LC 熒光檢測器檢測。
1.3 色譜條件
1.3.1 一維色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；流動相A1：0.1%三氟乙酸水；流動相B1：甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序見表1。紫外檢測器：254 nm。
1.3.2 二維色譜條件 二維液相系統(tǒng)連接流程見圖1。當六通閥從1-2 連通狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?-6 連通時，目標物被中心切入第二維液相體系；色譜柱：Thermal AccucoreTMPFP （3.0 mm×150 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；流動相A2：0.1%甲酸水；流動相B1：乙腈；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫程序見表1。熒光檢測器：激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長530 nm。
表1 液相色譜條件Table 1 Liquid chromatography condition
圖1 二維液相系統(tǒng)連接示意圖Fig.1 Schematic diagram of two-dimensional liquid system connection
2 結果與討論
?；撬釞z測的關鍵因素為衍生條件，包括衍生液的濃度，衍生環(huán)境的pH 值，和衍生時間。丹磺酰氯（二甲氨基-萘磺酰氯DNS-CL）是一種強熒光劑，能專一地與肽鏈N-端的α-氨基反應生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強的熒光信號。傳統(tǒng)嬰兒配方奶粉在沉淀蛋白后，用1.5 mg/mL DNS-CL 在堿性條件下衍生，得到熒光產(chǎn)物（參考國標GB 5009.169-2016）[18]。在全氨基酸水解配方奶粉中，其余氨基酸同樣可與DNS-CL 反應，導致?；撬岬难苌磻煌耆?，其回收率不到25%，相對標準偏差也較大（見表2）。本試驗將DNS-CL 的濃度大幅度提高，同時考慮其不溶于水的物理性質(zhì)，利用三乙胺（有機堿）代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碳酸氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH 值，并在60 ℃水浴中加熱，提高反應速率，使高濃度的DNS-CL 與牛磺酸充分反應。
表2 ?；撬嵩诓煌谭刍|(zhì)中的回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations （RSDs） of taurine in different matrixes
另外，對二維液相系統(tǒng)進行探究，二維液相色譜是將分離機理不同且相互獨立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構成的分離系統(tǒng)，通過柱切換技術完成?；撬嵩诙S色譜柱之間的流動[19]。樣品經(jīng)第一維色譜洗脫分離，鎖定目標物的出峰時間，進入切換閥的接口中，經(jīng)捕集和中心切割，被切換進入第二維色譜柱及檢測器[20]。由此得到的牛磺酸具有更高的峰容量和分辨力。2D-LC 系統(tǒng)更適合于?；撬嵩诙嘟M分、復雜基質(zhì)體系中的分離分析[21-23]。
2.1 DNS-CL 衍生液濃度
提高DNS-CL 的濃度，將包括?；撬嵩趦?nèi)的所有氨基酸一并衍生。DNS-CL 在乙腈中的溶解度為50 mg/mL，嘗試3 個衍生質(zhì)量濃度（15，30，45 mg/mL），研究全氨基酸水解配方奶粉的最佳衍生液濃度（表3）。
表3 全氨基酸水解配方奶粉中?；撬嵩诓煌せ酋Ｂ葷舛认碌幕厥章屎拖鄬藴势頣able 3 Effect of different DNS-CL concentration on the recoveries and relative standard deviations （RSDs）of taurine in amino-acid-hydrolyzed formula milk powder
隨著DNS-CL 濃度的增大，牛磺酸的回收率均有大幅提升。使用15.0 mg/mL DNS-CL 衍生，?；撬岬幕厥章实陀?0%，這說明衍生反應仍不完全。而30.0 mg/mL 和45.0 mg/mL 質(zhì)量濃度的DNS-CL 均能確保?；撬岬玫捷^為完整的衍生，其牛磺酸的回收率都在90%以上。衍生物丹磺酰-氨基乙磺酸DNS-NH-（CH2）2-SO3H 的色譜峰形更為尖銳，峰面積、峰高均大幅增加。值得一提的是，45.0 mg/mL DNS-CL 在與?；撬岱磻耐瑫r，因自身溶解度的問題，衍生一段時間后，會有反應物沉淀析出[24]，造成衍生過程的不均勻，重現(xiàn)性不理想，這可能是其結果的相對標準偏差更大的主要原因。另外，高濃度DNS-CL 衍生得到的丹磺酰-氨基乙磺酸中會伴有其它雜質(zhì)（圖5c），經(jīng)波長鑒定，與丹磺?；鶊F有關，其對色譜柱的分離和柱效都會有影響，目標峰的相對百分比也會下降，應盡量避免。在30.0 mg/mL 和45.0 mg/mL 的DNS-CL 對牛磺酸檢測結果沒有顯著性差異的情況下，本試驗選擇30.0 mg/mL DNS-CL 作為最終的衍生液。
2.2 衍生環(huán)境pH 值
?；撬崤cDNS-CL 的反應過程中，隨著熒光產(chǎn)物丹磺酰-氨基乙磺酸DNS-NH-（CH2）2-SO3H的生成，DNS-CL 上的Cl-與H+結合為HCl，降低了溶液的pH 值，會抑制反應向正方向進行。在衍生過程中，需保持溶液體系在堿性環(huán)境中進行。牛磺酸的最佳起始衍生環(huán)境通?？刂圃趐H=9.5 左右[25-26]?？紤]到DNS-CL 不溶于水，30.0 mg/mL DNS-CL 在與?；撬岱磻獣r，無法利用碳酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH 值，故本試驗嘗試用三乙胺（有機堿，TEA）來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碳酸鈉緩沖液。表4表明不同初始衍生溶液的pH 值對牛磺酸結果的影響。
表4 全氨基酸水解配方奶粉中?；撬嵩诓煌野诽砑恿肯碌幕厥章屎拖鄬藴势頣able 4 Effect of different triethylamine content on the recoveries and relative standard deviations （RSDs）of taurine in amino-acid-hydrolyzed formula milk powder
在不添加三乙胺的情況下，牛磺酸的回收率僅4.1%。加入三乙胺能迅速提升溶液的pH 值，三乙胺（C2H5）3N 中的N 孤電子對為SP3 雜化，很容易給出電子。同時，三乙胺結合氫質(zhì)子后，其3 個乙基可以通過超共軛效應來穩(wěn)定電荷，保證衍生溶液的穩(wěn)定性。10 μL 三乙胺可將溶液的pH 值調(diào)節(jié)至10.1，可以充分滿足衍生條件，其回收率達90%以上。隨著三乙胺的增加，目標物的色譜峰面積和回收率并沒有顯著性增加，考慮到三乙胺有一定的刺激性，在保證衍生充分性的前提下，盡量控制其添加量。本試驗最終選擇10 μL 三乙胺來調(diào)節(jié)衍生液的pH 值。
2.3 衍生反應時間
從圖2a 可知，在反應后的0.5 h，利用本方法得到的?；撬岷窟_25.6 mg/100 g （回收率64%），1 h 后接近企業(yè)理論添加量40 mg/100 g，1.5 h 后，其含量沒有顯著性增加。值得注意的是，本方法同樣可用于檢測普通嬰幼兒配方奶粉中的?；撬?。雖然奶粉基質(zhì)體系不同，但是在?；撬崽砑恿肯嗤那闆r下，其檢測結果隨反應時間增加的變化趨勢相同。經(jīng)1 h 的衍生，回收率均達90%以上 （圖2a 和圖2b）。本方法與國標GB 5009.169-2016 相比，當檢測同一普通嬰幼兒配方奶粉時，可將衍生時間縮短一半，衍生過程在1 h 左右完成，加快了反應效率，減少了反應時間和能耗（圖2b 和圖2c）；而圖2d 說明國標方法無法完全衍生全氨基酸水解配方奶粉。
圖2 衍生時間對牛磺酸含量和回收率的影響Fig.2 Effect of derivative time on the recoveries and relative standard deviations （RSDs） of taurine
綜上比較，DNS-CL 衍生法檢測?；撬岬膬?yōu)勢在于準確度很高，缺點在于專一性和特異性不強，柱前衍生時間較慢。本試驗利用高質(zhì)量濃度的DNS-CL 在60 ℃水浴中避光加熱反應物，使其充分反應，提高衍生速度和效率。對于全氨基酸水解配方奶粉基質(zhì)，加熱能提升高濃度DNS-CL 的溶解度，降低DNS-CL 的析出，使整個衍生反應更加均勻和徹底。全氨基酸水解配方特醫(yī)奶粉在30.0 mg/mL 的DNS-CL，10 μL 三乙胺的衍生條件下，60 ℃加熱1 h，衍生得到最理想量的丹磺酰-氨基乙磺酸，供熒光檢測器檢測。
2.4 液相條件
2.4.1 一維液相條件 比較圖3b 和3c 可知，全氨基酸水解配方奶粉中含有大量普通嬰幼兒奶粉中沒有的氨基酸。?；撬岜旧碜贤馕蘸苋鮗27]，與其余氨基酸衍生物相比，?；撬嵫苌锏捻憫『芏鄶?shù)量級，無法精確積分定量，應將其分離出來。為了保證將一維色譜柱中的牛磺酸全部中心切割至第二維色譜中，首先利用?；撬針藴势反_定其衍生物在一維色譜中的出峰位置（圖3a）。選擇0.1%三氟乙酸和甲醇為一維流動相，Agilent XDB-C18（150 mm）為色譜柱，紫外檢測器。流動相中的三氟乙酸與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來抑制待測物和反相色譜柱填料表面殘留的硅羥基的作用，確保?；撬嵫苌锪己玫姆逍?。另外，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200 nm，對多肽在低波長處的檢測干擾很小。?；撬嵫苌镌谧畲笞贤獠ㄩL（254 nm）吸收下的響應和峰面積雖很低，但這不影響六通閥切換的時間。一維液相色譜的切割時間最終設定為4.2 min 至5.2 min。此時，目標物順利被切入第二維液相色譜中，而其余氨基酸都被保留在一維體系中。
圖3 ?；撬嵫苌镆痪S紫外色譜圖Fig.3 One-dimensional Ultra Violet chromatogram of taurine derivative
2.4.2 二維液相條件 二維液相色譜既要考慮2個維度的兼容性，又要考慮不同液相體系存在的差異。本試驗選擇和一維液相條件相近的0.1%甲酸水和乙腈為二維流動相，Thermal AccucoreTM PFP 色譜柱，熒光檢測器。五氟苯基（PFP）固定相中的氟化基團可為鹵代化合物中含極性官能團的化合物提供獨特的選擇性，對含有雙苯環(huán)的丹磺酰-氨基乙磺酸具有很好的保留，同時，其高硅膠表面覆蓋率最大程度地減少了次級相互作用和峰拖尾的情況，可以獲得很好的峰形?？紤]到PFP 填料的穩(wěn)定性，選擇離解常數(shù)更溫和的0.1%甲酸水作為二維水相；化合物的保留時間更穩(wěn)定，柱壓更小的乙腈作為二維有機相。圖4說明0.1%甲酸水-乙腈體系無論在?；撬嵫苌锓迕娣e的大小還是穩(wěn)定性上，都是最佳選擇。圖5則說明牛磺酸衍生物在二維液相色譜中具有足夠強的熒光響應信號和良好的色譜峰形，分離度和靈敏度均滿足奶粉中牛磺酸檢測的要求。
圖4 牛磺酸衍生物在不同流動相體系中的峰面積Fig.4 Peak area of taurine derivatives by different mobile phase system
圖5 ?；撬嵫苌锒S熒光色譜圖Fig.5 Two-dimensional fluorescence chromatogram of taurine derivative
2.5 方法學評價
2.5.1 線性關系 ?；撬針藰淤|(zhì)量濃度在1.0～20.0 mg/L 范圍，標準曲線的線性良好，相關系數(shù)（R2）達到0.9996。其濃度與峰面積的線性方程為Y=10433.78X+1769.98。
2.5.2 回收率和精密度 測定4 種不同基質(zhì)奶粉中的牛磺酸含量，所得結果基本一致（見表5），回收率均在90%以上，相對標準偏差均在5%內(nèi)，說明該方法在檢測全氨基酸水解配方和普通嬰幼兒配方的奶粉時具有良好的精密度、穩(wěn)定性和一致性。
表5 4 種基質(zhì)奶粉中?；撬岬幕厥章屎拖鄬藴什頣able 5 Recoveries and relative standard deviation （RSDs） of taurine in four different matrix milk powder
3 結論
本文建立了一套二維液相色譜體系，測定特殊醫(yī)學用途全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸的含量。該方法在1.0～20.0 mg/L 范圍線性良好，線性相關系數(shù)0.9996，12 個實際樣品的平均回收率為95.2%，相對標準偏差1.86%。該方法準確性高，抗干擾能力強，縮短了丹磺酰氯的柱前衍生時間，具有較好的實際應用價值，解決了現(xiàn)行國家標準無法準確定量全氨基酸水解配方奶粉中?；撬岬暮?，為特殊醫(yī)學用途乳制品的檢測提供了新技術支持，有助于質(zhì)檢部門加強對乳制品市場的監(jiān)管。經(jīng)驗證，此方法同樣適合于其它奶粉基質(zhì)，可為深度水解配方奶粉，部分水解配方奶粉，和普通嬰幼兒配方奶粉的技術優(yōu)化提供新的思路。同時，此方法也被美國分析化學家協(xié)會（AOAC，Association of Official Analytical Chemists） 認可為檢測特殊奶粉基質(zhì)中?；撬岷康耐扑]性方法。
致謝
感謝上海市科委項目基金（NO.17DZ2201200）對本試驗的支持，感謝AOAC 委員會專家對本試驗方法的認可和優(yōu)化意見，并感謝美國奧本大學生物系統(tǒng)工程系教授對本試驗的指導和建議。
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牛磺酸（Taurine，C2H7NO3S，HO3S-CH2-CH2-NH2）化學名為β-氨基乙磺酸，是一種特殊的含硫非蛋白氨基酸，以游離狀態(tài)分布于組織間液和細胞內(nèi)液中。?；撬峋哂型怀龅纳硭幚碜饔茫苷{(diào)節(jié)機體內(nèi)糖類和脂類的代謝，提高機體免疫力，維持滲透壓平衡，增強細胞膜抗氧化能力等[1-3]，對嬰幼兒智力開發(fā)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也有重要作用[4-5]。目前，牛磺酸作為一種必備的營養(yǎng)強化劑添加在食品中，歐美等發(fā)達國家規(guī)定在嬰幼兒食品中必須添加一定量的牛磺酸。我國食品安全國家標準也規(guī)定，為了改善嬰幼兒配方食品的蛋白質(zhì)質(zhì)量，提高其營養(yǎng)價值，推薦嬰兒配方乳制品中添加適當牛磺酸。
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特醫(yī)奶粉的基質(zhì)體系相對于普通嬰兒配方奶粉復雜很多，蛋白質(zhì)被水解后形成大量的氨基酸于基質(zhì)中，對于牛磺酸的定量分析會產(chǎn)生很大的干擾。其中，薄層掃描法[9-10]很容易受到其余氨基酸的干擾，準確性較低；高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]雖應用廣泛，但對于奶粉本身的基質(zhì)效應顯著，重復性不理想；高效液相色譜——紫外檢測[14-16]，受到?；撬嶙陨碜贤馕蛰^弱的影響，靈敏度較低。
本文選擇基質(zhì)最為復雜的全氨基酸水解配方奶粉，改進前處理方法，以克服反應時間長的缺點[17]，保留丹磺酰氯柱前衍生定量準確的優(yōu)點，并構建二維液相系統(tǒng)（2D-LC）。在除去大量氨基酸的干擾后，利用熒光檢測器精確測定?；撬岷?。本試驗方法，不僅解決了國家標準目前無法準確定量全氨基酸水解配方奶粉中?；撬岷康膯栴}，對其余特殊醫(yī)學用途奶粉和普通嬰幼兒配方奶粉也同樣適用。
1 材料與方法
1.1 設備和試劑
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1.2 試驗方法
1.2.1 標準溶液和衍生溶液配制 精確稱取?；撬針藴势?00.0 mg 于100 mL 容量瓶，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液。試驗前，將儲備液用水稀釋成質(zhì)量濃度為1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/mL 的標準工作液進行衍生，由高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）檢測，以保留時間定性，外標法定量。
1.2.2 樣品前處理 提?。壕_稱?。?.00±0.05）g 奶粉樣品于50 mL 聚四氟乙烯塑料離心管中，加入約35 mL 超純水，渦旋5 min，超聲15 min，加入1 mL 150 g/L 亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 300 g/L 乙酸鋅溶液，去除基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，以9 000 r/min 離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度。
衍生：取1 mL 溶液于10 mL 聚四氟乙烯塑料離心管中，加入1 mL 30 mg/mL 高質(zhì)量濃度丹磺酰氯衍生液），10 μL 三乙胺，60 ℃避光加熱1 h（每15 min 取出渦旋30 s），加入0.1 mL 質(zhì)量濃度為20 mg/L 的鹽酸甲胺終止反應，過0.22 μm PTFE 濾膜，供2D-LC 熒光檢測器檢測。
1.3 色譜條件
1.3.1 一維色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；流動相A1：0.1%三氟乙酸水；流動相B1：甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序見表1。紫外檢測器：254 nm。
1.3.2 二維色譜條件 二維液相系統(tǒng)連接流程見圖1。當六通閥從1-2 連通狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?-6 連通時，目標物被中心切入第二維液相體系；色譜柱：Thermal AccucoreTMPFP （3.0 mm×150 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；流動相A2：0.1%甲酸水；流動相B1：乙腈；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫程序見表1。熒光檢測器：激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長530 nm。
表1 液相色譜條件Table 1 Liquid chromatography condition
圖1 二維液相系統(tǒng)連接示意圖Fig.1 Schematic diagram of two-dimensional liquid system connection
2 結果與討論
?；撬釞z測的關鍵因素為衍生條件，包括衍生液的濃度，衍生環(huán)境的pH 值，和衍生時間。丹磺酰氯（二甲氨基-萘磺酰氯DNS-CL）是一種強熒光劑，能專一地與肽鏈N-端的α-氨基反應生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強的熒光信號。傳統(tǒng)嬰兒配方奶粉在沉淀蛋白后，用1.5 mg/mL DNS-CL 在堿性條件下衍生，得到熒光產(chǎn)物（參考國標GB 5009.169-2016）[18]。在全氨基酸水解配方奶粉中，其余氨基酸同樣可與DNS-CL 反應，導致?；撬岬难苌磻煌耆?，其回收率不到25%，相對標準偏差也較大（見表2）。本試驗將DNS-CL 的濃度大幅度提高，同時考慮其不溶于水的物理性質(zhì)，利用三乙胺（有機堿）代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碳酸氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH 值，并在60 ℃水浴中加熱，提高反應速率，使高濃度的DNS-CL 與牛磺酸充分反應。
表2 ?；撬嵩诓煌谭刍|(zhì)中的回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations （RSDs） of taurine in different matrixes
另外，對二維液相系統(tǒng)進行探究，二維液相色譜是將分離機理不同且相互獨立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構成的分離系統(tǒng)，通過柱切換技術完成?；撬嵩诙S色譜柱之間的流動[19]。樣品經(jīng)第一維色譜洗脫分離，鎖定目標物的出峰時間，進入切換閥的接口中，經(jīng)捕集和中心切割，被切換進入第二維色譜柱及檢測器[20]。由此得到的牛磺酸具有更高的峰容量和分辨力。2D-LC 系統(tǒng)更適合于?；撬嵩诙嘟M分、復雜基質(zhì)體系中的分離分析[21-23]。
2.1 DNS-CL 衍生液濃度
提高DNS-CL 的濃度，將包括?；撬嵩趦?nèi)的所有氨基酸一并衍生。DNS-CL 在乙腈中的溶解度為50 mg/mL，嘗試3 個衍生質(zhì)量濃度（15，30，45 mg/mL），研究全氨基酸水解配方奶粉的最佳衍生液濃度（表3）。
表3 全氨基酸水解配方奶粉中?；撬嵩诓煌せ酋Ｂ葷舛认碌幕厥章屎拖鄬藴势頣able 3 Effect of different DNS-CL concentration on the recoveries and relative standard deviations （RSDs）of taurine in amino-acid-hydrolyzed formula milk powder
隨著DNS-CL 濃度的增大，牛磺酸的回收率均有大幅提升。使用15.0 mg/mL DNS-CL 衍生，?；撬岬幕厥章实陀?0%，這說明衍生反應仍不完全。而30.0 mg/mL 和45.0 mg/mL 質(zhì)量濃度的DNS-CL 均能確保?；撬岬玫捷^為完整的衍生，其牛磺酸的回收率都在90%以上。衍生物丹磺酰-氨基乙磺酸DNS-NH-（CH2）2-SO3H 的色譜峰形更為尖銳，峰面積、峰高均大幅增加。值得一提的是，45.0 mg/mL DNS-CL 在與?；撬岱磻耐瑫r，因自身溶解度的問題，衍生一段時間后，會有反應物沉淀析出[24]，造成衍生過程的不均勻，重現(xiàn)性不理想，這可能是其結果的相對標準偏差更大的主要原因。另外，高濃度DNS-CL 衍生得到的丹磺酰-氨基乙磺酸中會伴有其它雜質(zhì)（圖5c），經(jīng)波長鑒定，與丹磺?；鶊F有關，其對色譜柱的分離和柱效都會有影響，目標峰的相對百分比也會下降，應盡量避免。在30.0 mg/mL 和45.0 mg/mL 的DNS-CL 對牛磺酸檢測結果沒有顯著性差異的情況下，本試驗選擇30.0 mg/mL DNS-CL 作為最終的衍生液。
2.2 衍生環(huán)境pH 值
?；撬崤cDNS-CL 的反應過程中，隨著熒光產(chǎn)物丹磺酰-氨基乙磺酸DNS-NH-（CH2）2-SO3H的生成，DNS-CL 上的Cl-與H+結合為HCl，降低了溶液的pH 值，會抑制反應向正方向進行。在衍生過程中，需保持溶液體系在堿性環(huán)境中進行。牛磺酸的最佳起始衍生環(huán)境通?？刂圃趐H=9.5 左右[25-26]?？紤]到DNS-CL 不溶于水，30.0 mg/mL DNS-CL 在與?；撬岱磻獣r，無法利用碳酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH 值，故本試驗嘗試用三乙胺（有機堿，TEA）來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碳酸鈉緩沖液。表4表明不同初始衍生溶液的pH 值對牛磺酸結果的影響。
表4 全氨基酸水解配方奶粉中?；撬嵩诓煌野诽砑恿肯碌幕厥章屎拖鄬藴势頣able 4 Effect of different triethylamine content on the recoveries and relative standard deviations （RSDs）of taurine in amino-acid-hydrolyzed formula milk powder
在不添加三乙胺的情況下，牛磺酸的回收率僅4.1%。加入三乙胺能迅速提升溶液的pH 值，三乙胺（C2H5）3N 中的N 孤電子對為SP3 雜化，很容易給出電子。同時，三乙胺結合氫質(zhì)子后，其3 個乙基可以通過超共軛效應來穩(wěn)定電荷，保證衍生溶液的穩(wěn)定性。10 μL 三乙胺可將溶液的pH 值調(diào)節(jié)至10.1，可以充分滿足衍生條件，其回收率達90%以上。隨著三乙胺的增加，目標物的色譜峰面積和回收率并沒有顯著性增加，考慮到三乙胺有一定的刺激性，在保證衍生充分性的前提下，盡量控制其添加量。本試驗最終選擇10 μL 三乙胺來調(diào)節(jié)衍生液的pH 值。
2.3 衍生反應時間
從圖2a 可知，在反應后的0.5 h，利用本方法得到的?；撬岷窟_25.6 mg/100 g （回收率64%），1 h 后接近企業(yè)理論添加量40 mg/100 g，1.5 h 后，其含量沒有顯著性增加。值得注意的是，本方法同樣可用于檢測普通嬰幼兒配方奶粉中的?；撬?。雖然奶粉基質(zhì)體系不同，但是在?；撬崽砑恿肯嗤那闆r下，其檢測結果隨反應時間增加的變化趨勢相同。經(jīng)1 h 的衍生，回收率均達90%以上 （圖2a 和圖2b）。本方法與國標GB 5009.169-2016 相比，當檢測同一普通嬰幼兒配方奶粉時，可將衍生時間縮短一半，衍生過程在1 h 左右完成，加快了反應效率，減少了反應時間和能耗（圖2b 和圖2c）；而圖2d 說明國標方法無法完全衍生全氨基酸水解配方奶粉。
圖2 衍生時間對牛磺酸含量和回收率的影響Fig.2 Effect of derivative time on the recoveries and relative standard deviations （RSDs） of taurine
綜上比較，DNS-CL 衍生法檢測?；撬岬膬?yōu)勢在于準確度很高，缺點在于專一性和特異性不強，柱前衍生時間較慢。本試驗利用高質(zhì)量濃度的DNS-CL 在60 ℃水浴中避光加熱反應物，使其充分反應，提高衍生速度和效率。對于全氨基酸水解配方奶粉基質(zhì)，加熱能提升高濃度DNS-CL 的溶解度，降低DNS-CL 的析出，使整個衍生反應更加均勻和徹底。全氨基酸水解配方特醫(yī)奶粉在30.0 mg/mL 的DNS-CL，10 μL 三乙胺的衍生條件下，60 ℃加熱1 h，衍生得到最理想量的丹磺酰-氨基乙磺酸，供熒光檢測器檢測。
2.4 液相條件
2.4.1 一維液相條件 比較圖3b 和3c 可知，全氨基酸水解配方奶粉中含有大量普通嬰幼兒奶粉中沒有的氨基酸。?；撬岜旧碜贤馕蘸苋鮗27]，與其余氨基酸衍生物相比，?；撬嵫苌锏捻憫『芏鄶?shù)量級，無法精確積分定量，應將其分離出來。為了保證將一維色譜柱中的牛磺酸全部中心切割至第二維色譜中，首先利用?；撬針藴势反_定其衍生物在一維色譜中的出峰位置（圖3a）。選擇0.1%三氟乙酸和甲醇為一維流動相，Agilent XDB-C18（150 mm）為色譜柱，紫外檢測器。流動相中的三氟乙酸與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來抑制待測物和反相色譜柱填料表面殘留的硅羥基的作用，確保?；撬嵫苌锪己玫姆逍?。另外，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200 nm，對多肽在低波長處的檢測干擾很小。?；撬嵫苌镌谧畲笞贤獠ㄩL（254 nm）吸收下的響應和峰面積雖很低，但這不影響六通閥切換的時間。一維液相色譜的切割時間最終設定為4.2 min 至5.2 min。此時，目標物順利被切入第二維液相色譜中，而其余氨基酸都被保留在一維體系中。
圖3 ?；撬嵫苌镆痪S紫外色譜圖Fig.3 One-dimensional Ultra Violet chromatogram of taurine derivative
2.4.2 二維液相條件 二維液相色譜既要考慮2個維度的兼容性，又要考慮不同液相體系存在的差異。本試驗選擇和一維液相條件相近的0.1%甲酸水和乙腈為二維流動相，Thermal AccucoreTM PFP 色譜柱，熒光檢測器。五氟苯基（PFP）固定相中的氟化基團可為鹵代化合物中含極性官能團的化合物提供獨特的選擇性，對含有雙苯環(huán)的丹磺酰-氨基乙磺酸具有很好的保留，同時，其高硅膠表面覆蓋率最大程度地減少了次級相互作用和峰拖尾的情況，可以獲得很好的峰形?？紤]到PFP 填料的穩(wěn)定性，選擇離解常數(shù)更溫和的0.1%甲酸水作為二維水相；化合物的保留時間更穩(wěn)定，柱壓更小的乙腈作為二維有機相。圖4說明0.1%甲酸水-乙腈體系無論在?；撬嵫苌锓迕娣e的大小還是穩(wěn)定性上，都是最佳選擇。圖5則說明牛磺酸衍生物在二維液相色譜中具有足夠強的熒光響應信號和良好的色譜峰形，分離度和靈敏度均滿足奶粉中牛磺酸檢測的要求。
圖4 牛磺酸衍生物在不同流動相體系中的峰面積Fig.4 Peak area of taurine derivatives by different mobile phase system
圖5 ?；撬嵫苌锒S熒光色譜圖Fig.5 Two-dimensional fluorescence chromatogram of taurine derivative
2.5 方法學評價
2.5.1 線性關系 ?；撬針藰淤|(zhì)量濃度在1.0～20.0 mg/L 范圍，標準曲線的線性良好，相關系數(shù)（R2）達到0.9996。其濃度與峰面積的線性方程為Y=10433.78X+1769.98。
2.5.2 回收率和精密度 測定4 種不同基質(zhì)奶粉中的牛磺酸含量，所得結果基本一致（見表5），回收率均在90%以上，相對標準偏差均在5%內(nèi)，說明該方法在檢測全氨基酸水解配方和普通嬰幼兒配方的奶粉時具有良好的精密度、穩(wěn)定性和一致性。
表5 4 種基質(zhì)奶粉中?；撬岬幕厥章屎拖鄬藴什頣able 5 Recoveries and relative standard deviation （RSDs） of taurine in four different matrix milk powder
3 結論
本文建立了一套二維液相色譜體系，測定特殊醫(yī)學用途全氨基酸水解配方奶粉中牛磺酸的含量。該方法在1.0～20.0 mg/L 范圍線性良好，線性相關系數(shù)0.9996，12 個實際樣品的平均回收率為95.2%，相對標準偏差1.86%。該方法準確性高，抗干擾能力強，縮短了丹磺酰氯的柱前衍生時間，具有較好的實際應用價值，解決了現(xiàn)行國家標準無法準確定量全氨基酸水解配方奶粉中?；撬岬暮?，為特殊醫(yī)學用途乳制品的檢測提供了新技術支持，有助于質(zhì)檢部門加強對乳制品市場的監(jiān)管。經(jīng)驗證，此方法同樣適合于其它奶粉基質(zhì)，可為深度水解配方奶粉，部分水解配方奶粉，和普通嬰幼兒配方奶粉的技術優(yōu)化提供新的思路。同時，此方法也被美國分析化學家協(xié)會（AOAC，Association of Official Analytical Chemists） 認可為檢測特殊奶粉基質(zhì)中?；撬岷康耐扑]性方法。
致謝
感謝上海市科委項目基金（NO.17DZ2201200）對本試驗的支持，感謝AOAC 委員會專家對本試驗方法的認可和優(yōu)化意見，并感謝美國奧本大學生物系統(tǒng)工程系教授對本試驗的指導和建議。
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