王 謙，焦熙棟，閆博文，孟令璐，曹洪偉，黃建聯(lián)，趙建新，張 灝，陳 衛(wèi)，范大明

（1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 江蘇無錫 214122 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍與調(diào)理水產(chǎn)品加工重點實驗室 福建廈門 361022 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 4 福建省冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點實驗室 福建廈門 361022 5 福建安井食品股份有限公司 福建廈門 361022）

中國淡水鰱魚資源豐富，以鰱魚肌肉為原料加工的魚糜制品因高蛋白和低脂肪等特點而消費前景看好。在魚糜加工過程中大多出現(xiàn)凝膠劣化現(xiàn)象，魚肉被內(nèi)源性蛋白酶降解，導(dǎo)致魚糜凝膠強度低、口感差等問題[1]，其中淡水魚糜制品的凝膠劣化現(xiàn)象相較于海水魚更為嚴(yán)重[2]。大多數(shù)研究認(rèn)為肌纖維結(jié)合性蛋白酶是魚糜凝膠劣化現(xiàn)象的主要誘因，因為其與蛋白結(jié)合緊密，在魚糜加工過程中不易去除[3]。其中，組織蛋白酶L（EC 3.4.22.15）因水洗后殘留活性高、熱穩(wěn)定性強、抗凍性強和具有廣泛的底物特異性等特征而備受關(guān)注[4-6]。目前研究大多通過分子克隆手段獲得組織蛋白酶L，此方法難度較大，尤其是異源蛋白的表達(dá)受多種因素影響，從而間接影響酶的活性和結(jié)構(gòu)[7]。市售組織蛋白酶L 大多來源于哺乳動物，而魚類與哺乳動物組織蛋白酶L 的同源性較差，白鰱組織蛋白酶L 的基因片段尚未被鑒定，針對鰱魚組織蛋白酶L 的分子克隆研究極少。有必要對白鰱的內(nèi)源性組織蛋白酶L 進(jìn)行分離純化，為研究抑制魚糜凝膠劣化方法提供依據(jù)。

由于組織蛋白酶L 含量較少且其和肌肉結(jié)合緊密性強，現(xiàn)有的純化方法大多采用陰離子交換層析、分子篩層析、陽離子交換層析和染料親和層析組合的多步層析法來保證其純度，然而此法步驟繁雜，耗時長且回收率低[8]。本文在現(xiàn)有組織蛋白酶L 分離純化方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化酸處理、鹽析和透析等分離步驟，建立弱陰離子交換和分子篩兩步層析法，作為一種分離純化鰱魚組織蛋白酶L 的新型方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活白鰱（每條1 500～2 000 g），購買于附近超市，擊暈宰殺后裝冰速運至實驗室待用；蛋白純化層析柱 HiTrap SP HP、HiTrap Q HP、HiTrap DEAE FF （1.6 cm×2.5 cm） 和HiLoad16/600 Superdex 75 pg（1.6 cm×60 cm）Cytiva（思拓凡），原通用電氣醫(yī)療生命科學(xué)事業(yè)部；熒光合成底物ZPhe-Arg-MCA 和7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），美國sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇公司；Bradford蛋白測定試劑盒，上海碧云天有限公司；快速銀染試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；三氯乙酸、乙酸、乙醇、十二烷基磺酸鈉、氯化鈉、醋酸鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其它試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空斬拌乳化混合多功能一體機，德國Stephan 公司；AKTA pure 蛋白層析系統(tǒng)，瑞典通用電氣醫(yī)療集團(tuán)（GE Healthcare）；F-7000 熒光光譜儀，日本日立（Hitachi）公司；高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter 公司；79480-3 冷凍干燥機，美國CONCO 公司；蛋白電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶的分離 宰殺后的新鮮白鰱取其背部肌肉放入真空斬拌鍋低速斬拌至碎肉狀，加入4倍體積4 ℃預(yù)冷的25 mmol/L 乙酸鈉緩沖液（含5 mmol/L L-Cys、0.3 mmol/L PMSF，pH 5.0） 于4 ℃勻漿20 min 后12 000×g 離心20 min 取上清液，上清液用四層紗布過濾后即為粗酶分離液。

1.3.2 酸處理 用1 mol/L 鹽酸分別調(diào)整粗酶分離液的pH 值至3.0 和4.0，于30 ℃分別反應(yīng)5，10，15，20，25，30 min 后用1 mol/L 氫氧化鈉回調(diào)pH 值至5.8～6.0，立即12 000×g 離心20 min 取上清液測酶活，此上清液即為酸化級分。

1.3.3 硫酸銨鹽析 對酸化級分用40%～90%的硫酸銨分級沉淀，充分鹽析后12 000×g 離心20 min，分別收集沉淀和上清液，測其蛋白濃度和酶活。收集到的沉淀部分即為硫酸銨級分。

1.3.4 透析超濾濃縮 對硫酸銨級分用含有5 mmol/L L-Cys，pH 值為6.0 的20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液溶解，選用分子質(zhì)量分別為3 500，7 000，14 000 u 的透析膜于4 ℃下透析24 h。透析級分通過超濾濃縮即為濃縮粗酶液。

1.3.5 離子交換層析 將濃縮粗酶液用0.45 μm微孔濾膜過濾后分別上樣到HiTrap DEAE FF（1.6 cm×2.5 cm）、HiTrap Q HP （1.6 cm×2.5 cm）、HiTrap SP HP（1.6 cm×2.5 cm）離子交換柱，流動相A 分別為20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液 （含5 mmol/L L-Cys，pH 值為6.0，7.0）、50 mmol/L 的乙酸鹽緩沖液（含5 mmol/L L-Cys，pH 值為4.5），以0～1 mol/L 氯化鈉梯度洗脫，收集活性峰后透析、超濾濃縮，即為離子交換級分。流速1 mL/min，每管收集4 mL。

1.3.6 HiLoad16/600 Superdex 75 pg 凝膠過濾層析 將離子交換級分上樣于HiLoad16/600 Superdex 75 pg （1.6 cm×60 cm） 凝膠柱，用含0.2 mol/L 氯化鈉的20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液 （含5 mmol/L L-Cys，pH 值為6.0）平衡和洗脫，流速為1 mL/min，收集活性峰，每管4 mL，透析超濾濃縮凍干存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 組織蛋白酶L 活力測定 參照Yamashita等[9]的方法，將組織蛋白酶L 的特異性底物ZPhe-Arg-MCA 濃度配制成0.1 mol/L，將含有20 mmol/L 新制備的半胱氨酸的0.5 mL 4 mmol/L EDTA-0.4 mol/L 乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）加入到0.9 mL 樣品中?；旌先芤涸?5 ℃下預(yù)熱，同時快速加入0.5 mL 0.1 mmol/L 合成底物開始反應(yīng)。在25 ℃下反應(yīng)30 min 后，通過添加3.0 mL 0.1 mol/L三氯乙酸0.1 mol/L 乙酸緩沖液（pH 4.5）終止反應(yīng)。在激發(fā)波長370 nm 和發(fā)射波長460 nm 處測量了反應(yīng)體系中AMC 的熒光值。采用標(biāo)準(zhǔn)AMC樣品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在25 ℃下，按照1 個酶活單位為釋放1 nmol AMC 計算組織蛋白酶L 的活性。

1.3.8 蛋白質(zhì)濃度測定 參考考馬斯亮藍(lán)法，采用去垢劑兼容型Bradford 蛋白定量試劑盒，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。樣品組每根離心管加入100 μL 樣品稀釋液，迅速加入1 mL Bradford 工作液混勻，室溫15～30 ℃反應(yīng)10 min 后在分光光度計上測595 nm 處吸收值。

1.3.9 蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染法 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法制備樣品凝膠，電泳完成后采用銀染法監(jiān)測凝膠中低豐度蛋白質(zhì)[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗中隨機抽取樣本，每組樣品至少平行測定3 次。試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。測定樣品的平均值進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）。圖表用OriginPro 2017 軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 初步分離條件的優(yōu)化

目前已有較多研究從多種生物的肌肉或者內(nèi)臟中分離純化出組織蛋白酶L，包括從鯉魚背部白肌[11]、耗牛肉[12]、牛胰臟[6]、魷魚肝臟[13]等，主要采用硫酸銨鹽析和蛋白柱層析等多種蛋白純化方法相結(jié)合的手段。為了除去雜蛋白，提高酶的比活，本研究在初步提取階段對酸化、鹽析、透析3 個步驟進(jìn)行條件優(yōu)化。

2.1.1 酸處理條件的優(yōu)化 因為組織蛋白酶L 具有較高的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，通常會對粗酶液進(jìn)行先酸化保溫后回調(diào)pH 值的酸處理手段來提高回收率[15]。不同的酸處理條件下粗酶液中組織蛋白酶L 的活性變化如圖1所示，粗酶液經(jīng)過pH 3.0，40 ℃熱處理10 min 后，其中組織蛋白酶L 比活增加最多，是粗酶液的37 倍，故選取pH 3.0，40 ℃熱處理10 min 后回調(diào)至pH 6.0 作為酸處理最優(yōu)條件。

圖1 不同酸處理條件對組織蛋白酶L 活性的影響Fig.1 Effect of acid condition on cathepsin L activity

2.1.2 鹽析條件的優(yōu)化 硫酸銨鹽析法可以從大量粗酶液中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，還可以除去脂類等雜質(zhì)[14]。粗酶液的鹽析曲線如圖2所示，可以看出隨著硫酸銨飽和度的增加，組織蛋白酶L在30%～40%的蛋白沉淀中比活相對較少，只有1 U/mg 左右，而在55%的硫酸銨中開始大量沉降，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到55%，70%，80%，90%時，比活分別達(dá)到2.40，2.63，2.08，1.91 U/mg，因此選用55%～90%的硫酸銨飽和度可以最大限度回收目的蛋白。

圖2 組織蛋白酶L 的鹽析曲線Fig.2 Salting out curve of cathepsin L

2.1.3 透析條件的優(yōu)化 對用3 種透析袋分離得到的不同分子質(zhì)量的組分進(jìn)行組織蛋白酶L 活性測定，測定結(jié)果見表1。由表1可知，通過7 000 u透析袋透析得到的組分中組織蛋白酶L 的比活最高，通過14 000 u 透析袋的組分比活最低，表明粗酶液在7 000～14 000 u 分子質(zhì)量范圍內(nèi)存有活性的組織蛋白酶L 中間體。這與前人的報道[16-17]一致，組織蛋白酶L 的分子質(zhì)量在30～45 ku 范圍內(nèi)，但在機體內(nèi)組織蛋白酶L 存在多種形式，包括酶-內(nèi)源抑制劑形式、無活性且低活性的前體形式和有活性的成熟單體形式，同時在酸化處理過程中會形成各種分子質(zhì)量形式的活性中間體和小分子質(zhì)量的成熟體，所以實際得到的產(chǎn)物是組織蛋白酶L 各種活性形式的混合物。因此為了最大限度回收具有活性的組織蛋白酶L，本法選取7 000 u 的透析袋進(jìn)行粗分離。

表1 不同分子質(zhì)量透析袋對組織蛋白酶L 活性的影響Table 1 Effects of molecular weight of dialysis bags on cathepsin L activity

2.2 蛋白純化條件的優(yōu)化

2.2.1 離子交換層析柱的選擇 Liu 等[18]采用離子交換層析、分子篩層析、陽離子交換層析和親和層析四步純化出鰱魚背肌中的組織蛋白酶L；Hu等[19]采用一步離子交換色譜法從鯉魚背肌中純化得到組織蛋白酶L；Cui 等[6]和Ogata 等[20]的純化結(jié)果表明強陽離子交換可以大幅提高組織蛋白酶L的比活，表明陽離子交換柱對組織蛋白酶L 具有很好的分離效果。為了選取適合的蛋白純化層析柱，試驗中采用強陽離子（HiTrap SP HP）、強陰離子 （HiTrap Q HP） 和弱陰離子 （HiTrap DEAE FF）3 種離子交換柱對粗酶液中的組織蛋白酶L進(jìn)行分離，通過組織蛋白酶L 比活來篩選合適的離子交換柱，結(jié)果如圖3所示。

粗酶液經(jīng)弱陰離子柱交換層析（圖3a）后，在40～80 mL 的洗脫體積范圍內(nèi)得到最高活力為236 U/L 的組織蛋白酶L 活性部分；經(jīng)強陰離子柱交換層析（圖3b）后，在15～30 mL 的洗脫體積范圍內(nèi)得到最高活力為181 U/L 的組織蛋白酶L 活性部分；而經(jīng)強陽離子柱交換層析（圖3c）后，僅在50～60 mL 的洗脫體積范圍內(nèi)得到最高活力為113 U/L 的組織蛋白酶L 活性部分。陰離子柱分離得到的蛋白峰分離度更好，分辨率更高，且目的蛋白峰紫外強度在16 mAU 左右，而陽離子柱分離得到的蛋白峰數(shù)量多且粘連，其目的蛋白峰紫外強度在2 mAU 左右，說明陰離子交換柱能有效吸附鰱魚組織蛋白酶L，且有效分離雜蛋白。此結(jié)果與前人的研究結(jié)果類似[8，18-19，21]。

對比圖3a 和圖3b，可以看出經(jīng)弱陰離子柱分離得到的目的蛋白峰寬更大，且其洗脫得到的活性蛋白溶液中組織蛋白酶L 活力更高，是強陰離子柱的1.3 倍。該結(jié)果可能是因為強陰離子柱的適用pH 值范圍在2～12，弱陰離子柱的適用pH值在2～9，故對于酸性蛋白酶（結(jié)果見圖8）的組織蛋白酶L 分離，弱陰離子柱的分辨率要高于強陰離子。因此根據(jù)試驗結(jié)果選取弱陰離子柱（Hi-Trap DEAE FF）作為組織蛋白酶L 分離純化的離子柱。

圖3 采用不用離子交換層析柱——HiTrap DEAE FF（a）、HiTrap Q HP（b）、HiTrap SP HP（c）對組織蛋白酶L 純化效果影響Fig.3 Effect of ion exchange chromatography column on purification of cathepsin L HiTrap DEAE FF （a），HiTrap Q HP （b），HiTrap SP HP （c）

2.2.2 流動相A 的pH 值選擇 離子交換層析的基本反應(yīng)過程是填料與待分離物質(zhì)以及緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強度和pH 值的選擇對于分離效果有很大的影響。平衡緩沖液的離子強度和pH 值的選擇首先要保證待分離蛋白的穩(wěn)定，并盡量使目的蛋白和雜質(zhì)與離子交換填料的結(jié)合有較大的差別，使目的蛋白與離子交換填料有穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)與離子交換填料結(jié)合不穩(wěn)定，因此選擇合適的平衡緩沖液就可以去除大量的雜蛋白[22]。大部分研究選取20 mmol/L、pH 6.0 磷酸鹽緩沖液作為平衡緩沖液，也有選取20 mmol/L、pH 7.5 的Tris-HCl 緩沖液作為弱陰離子柱的平衡緩沖液[13]。由于本試驗選取的弱陰離子柱填料有所改進(jìn)，為了確定其最佳平衡緩沖液pH 值，分別選取pH 6.0 和pH 7.0 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液對組織蛋白酶L 分離，蛋白層析曲線結(jié)果如圖4所示。通過對比可以看出在pH 6.0 條件下此弱陰離子柱對組織蛋白酶L 的分離度更好，且其最高酶活（236 U/L）是pH 7.0 條件下（180 U/L）的1.31 倍。pH 6.0 條件下在280 nm處檢測到的目的蛋白峰強度為4～15 mAU，比pH 7.0 條件下的2～7 mAU 高，故選取20 mmol/L、pH 6.0 磷酸鹽緩沖液作為此弱陰離子柱的平衡緩沖液。該結(jié)果可能是因為pH 6.0 更接近組織蛋白酶L 的等電點[7，23]，目的蛋白在其等電點處更容易保留。雖然根據(jù)等電點原理，目的蛋白在pH 7.0 的離子化程度更大，更容易被洗脫，然而試驗結(jié)果在pH 7.0 時不好的原因可能是體系的離子強度大導(dǎo)致磷酸根和樣品會競爭填料上的弱堿性陰離子基團(tuán)，從而導(dǎo)致洗脫后目的蛋白峰面積較小。

圖4 采用不用pH 值平衡緩沖液——pH 6.0（a）、pH 7.0（b）對組織蛋白酶L 純化效果影響Fig.4 Effect of different pH balance buffer on the purification of cathepsin L pH 6.0 （a），pH 7.0 （b）

2.2.3 分子篩層析 為了進(jìn)一步純化組織蛋白酶L，將經(jīng)弱陰離子柱交換后的活性部分收集濃縮加到平衡好的Superdex 75 pg 分子篩層析柱，所得層析洗脫曲線如圖5所示，可以看出在40～50 mL洗脫體積處有蛋白組分Ⅰ和組分Ⅱ，在50～70 mL洗脫體積處有一組紫外信號較弱的蛋白組分Ⅲ，在100～120 mL 洗脫體積處有紫外信號較強的蛋白組分Ⅳ，通過酶活測定表明蛋白組分Ⅲ為組織蛋白酶L，同時也表明分子篩層析柱能夠?qū)⒔M織蛋白酶L 與其它雜蛋白進(jìn)一步分離。

圖5 組織蛋白酶L 的Superdex 75 pg 分子篩層析洗脫曲線Fig.5 Superdex 75 pg molecular sieve elution curve of cathepsin L

2.3 組織蛋白酶L 初步分離及純化方法的評價

2.3.1 SDS-PAGE 電泳法鑒定純度 將具有組織蛋白酶L 活性的洗脫部分收集濃縮后通過SDSPAGE 電泳銀染色法鑒定其純度，結(jié)果如圖6所示。泳道2 顯示粗酶液通過弱陰離子交換層析后大分子質(zhì)量雜蛋白已經(jīng)得到有效去除，但仍有部分雜蛋白保留。泳道3 顯示通過分子篩層析柱的組織蛋白酶L 活性部分在45 ku 處出現(xiàn)單一條帶，表明上述兩步組合層析法可獲得電泳純的組織蛋白酶L。其它研究從鯉魚中獲得的組織蛋白酶L 分子質(zhì)量為36 ku[19]，從藍(lán)園鲹中純化的組織蛋白酶L 分子質(zhì)量為30 ku[21]，Li 等[8]證明鰱魚的組織蛋白酶L 前體的分子質(zhì)量為78 ku，而組織蛋白酶L 之間分子質(zhì)量的差異可以歸因于使用的魚類種類和試驗條件的不同。由于本研究中純化的組織蛋白酶L 分子質(zhì)量為45 ku，低于組織蛋白酶L 前體的分子質(zhì)量（78 ku），故推測本研究中純化的組織蛋白酶L 為成熟形態(tài)。

圖6 鰱魚背肌組織蛋白酶L 的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of cathepsin L in silver carp dorsal muscle

2.3.2 粗分離及純化結(jié)果表征 粗分離各步及層析過程中組織蛋白酶L 的比活和純化倍數(shù)結(jié)果見表2，經(jīng)過兩步層析法最終純化倍數(shù)為487 倍，從1 000 g 鰱魚肌肉中分離純化的組織蛋白酶L 約22 mg。結(jié)果顯示粗分離步驟的純化效率一般，經(jīng)弱陰離子交換層析后純化倍數(shù)相較于粗酶液提高了近3 倍，分子篩層析一步的純化倍數(shù)相比陰離子層析提高不顯著，說明陰離子交換柱已去除大部分雜蛋白。Hu 等[19]采用一步離子交換色譜法從1 000 g 魚中純化出4.35 mg 組織蛋白酶L，純化倍數(shù)為18 倍。Li 等[8]采用離子交換、凝膠過濾和親和層析四步法從1 000 g 魚肉中純化出0.32 mg 組織蛋白酶L，純化倍數(shù)為2 130 倍。不同的純化結(jié)果與魚的種類有關(guān)[24]，此外使用的層析步驟越多，其純化倍數(shù)越高，回收率越低。綜上所述，本試驗中采用的弱陰離子交換和分子篩兩步層析法純化倍數(shù)和回收率均較高且簡單省時。

表2 鰱魚背肌組織蛋白酶L 純化結(jié)果表Table 2 Purification result of cathepsin L from silver carp dorsal muscle

2.4 組織蛋白酶L 的基本酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 由圖7可知，隨著反應(yīng)溫度增加，白鰱組織蛋白酶L 的活性先增加后急劇下降，其最適反應(yīng)溫度為55 ℃，與大部分研究報道的45～55 ℃結(jié)果吻合[11，13，25]。且組織蛋白酶L 的熱穩(wěn)定性隨溫度升高急劇下降，在50℃保溫1 h 時活性仍保留50%以上，而78 ℃下保溫1 h 后幾乎無活性，該結(jié)果表明組織蛋白酶L有一定的耐熱性。

圖7 組織蛋白酶L 的溫度-相對酶活曲線Fig.7 Temperature-relative enzyme activity curve of cathepsin L

2.4.2 最適反應(yīng)pH 值和pH 值穩(wěn)定性 由圖8可知，鰱魚組織蛋白酶L 的最適反應(yīng)pH 值為5～5.5。酸性條件下其活性有所保持，其中pH 3.0 時仍然保持了45%的活性。堿性條件下此酶的活性急劇下降，在pH 7.0 時仍有20%左右的活性，在pH 8.0 時幾乎失活，表明此酶是偏酸性蛋白酶。

2.4.3 底物專一性和反應(yīng)動力學(xué)常數(shù) 經(jīng)測定，白鰱的組織蛋白酶L 對其專一性熒光底物ZPhe-Arg-MCA 有較強的水解活性，對組織蛋白酶B 和組織蛋白酶H 的專一性熒光底物幾乎沒有水解活性，由其反應(yīng)動力學(xué)曲線（圖9）和米氏方程雙倒數(shù)曲線（圖10）可知其最大反應(yīng)初速度達(dá)到130 U/mg，Km值為49 μmol/L。

圖9 組織蛋白酶L 水解Z-Phe-Arg-MCA 的反應(yīng)動力學(xué)曲線Fig.9 Kinetic curves of the hydrolysis of Z-Phe-Arg-MCA by cathepsin L

圖10 組織蛋白酶L 水解Z-Phe-Arg-MCA 的雙倒數(shù)曲線Fig.10 Double reciprocal curve of hydrolyzing Z-Phe-Arg-MCA by cathepsin L

3 結(jié)論

本研究對白鰱中組織蛋白酶L 的粗分離和純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，重點研究了初步提取過程中硫酸銨飽和度、酸處理條件和透析袋分子質(zhì)量對粗酶液中組織蛋白酶L 活性的影響，以及純化過程中不同類型離子交換層析柱和離子交換平衡緩沖液pH 值對蛋白層析純化結(jié)果的影響。結(jié)果表明，鹽析最佳硫酸銨飽和度范圍是55%～90%、酸處理最優(yōu)條件為pH 3.0，40 ℃熱處理10 min 后回調(diào)至pH 6.0、透析袋最佳分子質(zhì)量為7 000 u，以上試驗條件可以最大限度回收目的蛋白。采用弱陰離子交換和分子篩兩步層析法，選取20 mmol/L、pH 6.0 磷酸鹽緩沖液作為弱陰離子柱的平衡緩沖液可得到45 ku 電泳純組織蛋白酶，其純化倍數(shù)為487，回收率為22 mg/1 000 g。兩步層析法較一步離子交換層析法純化倍數(shù)更高，較四步組合層析法回收率更高且簡單省時。本法的建立為探究魚糜凝膠劣化現(xiàn)象的有效抑制方法奠定了良好的基礎(chǔ)。