苗壯壯，楊淑娟，劉凱龍，武 婷，郭 帥，白 梅，王記成，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特 010018）

人體內(nèi)的微生物群落獨特而復(fù)雜，腸道菌群形成多樣而穩(wěn)定的動態(tài)平衡，可調(diào)節(jié)宿主穩(wěn)態(tài)，對人體健康非常重要[1]。2001年，世界衛(wèi)生組織（WHO）和糧農(nóng)組織（FAO）提出一個定義：“當攝入足夠數(shù)量時，需要對宿主產(chǎn)生足夠益處的活性微生物，稱為益生菌”[2-4]。2020年，中國食品科學技術(shù)學會發(fā)布了益生菌科學共識，提出益生菌需要具備3 個特征，第一需要足夠的數(shù)量，第二需要對人體健康產(chǎn)生益處，第三必須是活性的微生物[5]。

雙歧桿菌是人體的胃腸道中具有代表性的一類有益的微生物，其具有免疫調(diào)節(jié)，改善腸道、生物性屏障和抗腫瘤等多種重要的生理功能，對人體的健康具有重要的作用[6]。本研究所用乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）Probio-M8，分離自內(nèi)蒙古呼和浩特市健康婦女母乳[7]。Liu 等[8]在2020年研究了乳雙歧桿菌Probio-M8 具有良好的胃腸消化耐受特性。2020年，翟云等[9]對免疫抑制模型大鼠灌服乳雙歧桿菌Probio-M8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以提高大鼠的特異性和非特異性免疫應(yīng)答調(diào)控的能力，說明灌服益生菌對免疫抑制大鼠的免疫調(diào)節(jié)有一定的促進作用。熊濤等[10]發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬的酪乳桿菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和人體胃腸道中，不僅具有十分良好的耐酸耐膽鹽的能力及較強的黏附功能；而且還能耐受人體胃腸道的防御機制并可在腸道內(nèi)定殖。本研究用副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）PC-01分離自西藏拉薩地區(qū)當雄縣龍仁鄉(xiāng)酸牦牛奶[11]。發(fā)酵乳是將益生菌傳遞到人體胃腸道的理想載體，是益生菌在功能食品領(lǐng)域的重要應(yīng)用形式[12]。

本文研究益生菌發(fā)酵乳發(fā)酵過程中的微流變學特性，微流變的靈敏度較高，通過對發(fā)酵乳體系中粒子運動的追蹤來表征該樣品的黏彈性變化，在不破壞發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)的情況下研究發(fā)酵乳樣品的流變特性。測定發(fā)酵過程和貯藏期間的活菌數(shù)、pH 值、滴定酸度、黏度和持水性，評價添加益生菌對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌種和培養(yǎng)基 本研究所用基礎(chǔ)發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌ND02 和嗜熱鏈球菌ND03）、乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 直投式發(fā)酵劑，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室提供。

1.1.2 主要試驗材料 牛乳，蒙牛乳業(yè)有限公司；白砂糖，廣西鳳糖有限公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基，英國Oxoid 公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽，北京酷來搏科技有限公司；萬古霉素，陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 黏度計DV-2T 型，Brookfield 公司；pH 計FE28 型，梅特勒（上海）有限公司；微流變儀Rheolaser Master，法國Formulaction 公司；超凈工作臺（SJ-CJ-2FDQ），蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；高壓均質(zhì)機SPXAPV1000型，上海歐河機械設(shè)備有限公司；水浴鍋，一恒科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳制備 將6%（質(zhì)量分數(shù)） 白砂糖溶解于94%（質(zhì)量分數(shù)）牛乳中，加熱至65 ℃，均質(zhì)（20 MPa）后，于95 ℃、5 min 殺菌，冷卻到37 ℃接種益生菌和發(fā)酵劑。各試驗組發(fā)酵劑接種情況如表1。將樣品于37 ℃恒溫發(fā)酵至pH 4.50 為終點，冰水浴冷卻，置于4 ℃后熟24 h 和貯藏28 d，發(fā)酵過程中每間隔2 h 取發(fā)酵乳樣檢測，貯藏期間每隔7 d 取樣品進行貯藏指標的檢測。

表1 試驗分組明細Table 1 Experiment grouping details

1.2.2 微流變特性的測定 取接種發(fā)酵劑后的乳樣品20 mL，倒入無菌微流變儀專用玻璃管（內(nèi)徑27.5 mm），迅速將玻璃管轉(zhuǎn)移至測定槽中，流變儀設(shè)置為37 ℃。每1 min 測量1 次，至發(fā)酵終點。原始數(shù)據(jù)的收集和分析在儀器上的軟件進行。

1.2.3 活菌數(shù)的測定 本試驗采用的是平板傾注法計活菌數(shù)。發(fā)酵乳樣品中乳雙歧桿菌Probio-M8采用ML 固體培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)72 h；副干酪乳桿菌PC-01 采用固體培養(yǎng)基MRS-V（萬古霉素10 mg/L） 進行選擇培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)72 h；均在厭氧條件下培養(yǎng)[13]。

1.2.4 酸度的測定 采用FE28 型pH 計直接測定pH 值；滴定酸度根據(jù)GB 5413.34-2010 中“乳和其它乳制品酸度的測定”的方法，每個樣品測定3 組平行[14]。

1.2.5 黏度的測定[15]將發(fā)酵乳樣品放置室溫后，利用DV-2T 黏度計測發(fā)酵乳樣品，3 次平行。測定條件：選擇4#轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間是30 s。

1.2.6 持水性的測定 稱取20 g 發(fā)酵乳樣品，放置在有定量濾紙的玻璃漏斗中，室溫下靜置120 min 后收集濾液，立即稱取濾液的質(zhì)量[16]。計算公式：

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 本試驗的樣品每組均至少測定3 次平行，結(jié)果用“平均值±方差”表示，采用SPSS分析各樣本間的差異，P<0.05 表示差異顯著；作圖采用Origin 2018 軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 固液平衡值的檢測結(jié)果

本研究采用多頻擴散波譜法對添加不同益生菌發(fā)酵乳的凝膠過程進行了微流變學特征分析。隨著時間的推移，EI 與彈性模量成正比，MVI 與黏性模量成正比，F(xiàn)I 反映微觀粒子運動的快慢，SLB 與發(fā)酵乳產(chǎn)品的黏彈性性能成正比，并給出了類固液比[17]。固液平衡值（SLB）直接表現(xiàn)了產(chǎn)品偏向于固態(tài)或者液態(tài)與時間對應(yīng)的函數(shù)關(guān)系，當0

圖1 發(fā)酵過程中固液平衡值的變化Fig.1 Changes of solid liquid balance （SLB）during fermentation

2.2 彈性因子的檢測結(jié)果

彈性因子（EI）作為時間的函數(shù)可直接反映彈性模量，即儲能模量在一定時間內(nèi)的變化性，可快速、簡便地表征一個樣品的彈性模量。EI 值越大，說明發(fā)酵乳樣品的凝膠結(jié)構(gòu)就越強，樣品也就會越穩(wěn)定[20]。發(fā)酵過程中彈性因子變化如圖2所示，發(fā)酵乳樣品的彈性因子在最初4.5 h 內(nèi)保持了穩(wěn)定，但FI、SLB 和MVI 值在此期間處于較大程度的波動狀態(tài)，因為酪蛋白沒有形成凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，樣品表現(xiàn)為高流動性的低彈性、低黏度的不穩(wěn)定狀態(tài)[21]。4.5 h 開始Probio-M8 組和Probio-M8+PC-01 組EI 出現(xiàn)拐點迅速垂直上升，到達凝膠點。PC-01 組和對照組5 h 左右呈現(xiàn)相同趨勢，這進一步說明添加益生菌提前了EI 的變化。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵乳中酪蛋白完全解離并迅速聚集形成凝膠結(jié)構(gòu)，EI 值達到最大[22]。添加Probio-M8 和Probio-M8+PC-01 組EI 值迅速上升，EI 值變化顯著快于PC-01 組和對照組，各組EI值迅速達到最高后略微下降直至發(fā)酵終點，這可能是因為形成不穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。對照組的EI 值最大，Probio-M8+PC-01 組EI 值最小，這可能是添加益生菌在一定程度上降低了發(fā)酵乳的彈性，與蔡淼等[23]的研究結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵過程中彈性因子（EI）的變化Fig.2 Changes of elasticity index （EI）during fermentation

2.3 黏性因子的檢測結(jié)果

黏性因子（MVI）反映樣品在微米尺度的黏性特征[24]。黏性因子作為一個時間的函數(shù)能直接表示黏性模量，黏性因子可以顯示發(fā)酵乳黏度的變化[18]。發(fā)酵過程中黏性因子的變化如圖3所示，從發(fā)酵開始到4.5 h 左右，各組MVI 值在同一時期保持在一定水平波動，這是因為凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)沒有形成，為低黏度的初始停滯階段[25]。Probio-M8組和Probio-M8+PC-01 組在4.5 h 后，樣品MVI呈迅速上升趨勢，這可能是酪蛋白膠粒開始逐漸的解離，乳液中凝膠逐漸開始形成，因此發(fā)酵乳進入了黏度快速變化的階段，隨后各組發(fā)酵乳樣品的黏性因子快速的增加到最大，進入了高黏度階段[26]；PC-01 組和對照組在5 h 左右出現(xiàn)同樣的趨勢。Probio-M8 組、PC-01 組和Probio-M8+PC-01組產(chǎn)黏速度相對更快，說明添加益生菌可以加快產(chǎn)黏速度。發(fā)酵終點時，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成后各組最終形成了穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，發(fā)酵乳樣品的黏稠度無明顯差異。

圖3 發(fā)酵過程中黏性因子（MVI）的變化Fig.3 Changes of macroscopic viscosity index （MVI）during fermentation

2.4 流動因子的檢測結(jié)果

流動因子（FI）的變化能反映發(fā)酵乳樣品中微觀粒子運動的快慢，高流動因子（約10 Hz）表明此時樣品為液態(tài)性質(zhì)，低流動因子（約10-2Hz）表明樣品為固態(tài)性質(zhì)，F(xiàn)I 值越大則粒子運動越快，流動性越強[27]。發(fā)酵過程中流動因子的變化由圖4可知，從發(fā)酵開始到4.5 h，各組FI 值處于波動狀態(tài)屬于液態(tài)性質(zhì)，4.5 h 后Probio-M8 組和Probio-M8+PC-01 組出現(xiàn)拐點，F(xiàn)I 值由102Hz 直線下降至10-1Hz 后平緩下降，達到10-2Hz 后基本保持不變，樣品具有較高的黏性液體性質(zhì)，PC-01 組和對照組在5 h 后也出現(xiàn)相同的趨勢。到發(fā)酵終點，對照組的FI 最低，與MVI 結(jié)果相對應(yīng)。

圖4 發(fā)酵過程中流動因子（FI）的變化Fig.4 Changes of fluidity index （FI）during fermentation

2.5 活菌數(shù)的變化

發(fā)酵過程及貯藏期間活菌數(shù)的變化由表2所示，發(fā)酵過程，發(fā)酵中的活菌數(shù)均呈上升趨勢（P<0.05），在發(fā)酵終點時Probio-M8 組活菌數(shù)達到（7.89±0.01）lg （CFU/mL），PC-01 組副干酪乳桿菌PC-01 的活菌數(shù)達到 （7.28±0.01）lg（CFU/mL）；Probio-M8+PC-01 組兩種益生菌的活菌數(shù)與Probio-M8 組和PC-01 組的活菌數(shù)差異不顯著。在貯藏1～14 d 時，Probio-M8 的活菌基本保持不變，14 d 后呈下降趨勢（P<0.05），在貯藏28 d 時活菌數(shù)達到（7.34±0.05）lg（CFU/mL）；值得關(guān)注的是：PC-01 在貯藏1～28 d 中活菌數(shù)在持續(xù)上升（P<0.05），在貯藏28 d 時活菌數(shù)達到 （7.75±0.02）lg（CFU/mL），PC-01 的活菌數(shù)顯著高于Probio-M8，這可能是因為PC-01 具有更好的耐酸特性，在貯藏過程中副干酪乳桿菌PC-01 保持更好的活力。本試驗證明應(yīng)用乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 在發(fā)酵乳中保持益生菌活力的穩(wěn)定性，可以充分保證益生功效的發(fā)揮。

表2 發(fā)酵及貯藏過程中發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化Table 2 During storage and fermentation viable count changes of fermented milk

2.6 酸度的變化

pH 值和滴定酸度影響益生菌在發(fā)酵及貯藏過程中的生存能力，影響發(fā)酵乳制品的質(zhì)量，產(chǎn)酸是酸奶發(fā)酵劑的主要功能[28]。由圖5所示，pH 值在發(fā)酵期間各組均呈快速下降的趨勢 （P<0.05）。在發(fā)酵初期（0～2 h），生長速度緩慢，酸度變化不大。發(fā)酵2 h 后，菌株進入對數(shù)生長期，增長速度加快，酸度變化明顯，由于乳酸菌代謝乳糖，產(chǎn)生大量乳酸，促進pH 值加速下降[29]。各組達到發(fā)酵乳發(fā)酵終點pH 4.5 所用的時間，由快到慢分別是Probio-M8 組和Probio-M8+PC-01 組（7.5 h）、PC-01 組（8 h）和對照組（8.5 h），在貯藏期間按各組pH 值在4.2～4.3 之間，變化不明顯；在發(fā)酵過程中TA 迅速上升（P<0.05），發(fā)酵終點滴定酸度平均值為85.25 °T，發(fā)酵酸度適中。在4 ℃貯藏期間，TA稍有下降，但變化幅度小，最終穩(wěn)定在100°T 以內(nèi)。研究表明，添加益生菌株縮短發(fā)酵時間、產(chǎn)酸速率變快，貯藏期間添加益生菌發(fā)酵乳的pH 值和滴定酸度沒有顯著變化，未增加后酸，說明益生菌適宜在發(fā)酵乳中生產(chǎn)應(yīng)用。

圖5 發(fā)酵及貯藏過程中發(fā)酵乳酸度的變化Fig.5 Acidity changes of fermented milk during fermentation and storage

2.7 黏度的變化

發(fā)酵乳是不可逆的凝膠，黏度是反映發(fā)酵乳品質(zhì)的重要指標，適當?shù)酿ざ饶軌虍a(chǎn)生良好的感官品質(zhì)[30]。貯藏過程中發(fā)酵乳黏度的變化如圖6所示，在貯藏期間，加益生菌組的黏度均高于對照組（P<0.05），隨著貯藏時間的延長，黏度首先上升后下降。Probio-M8 組在貯藏期間黏度明顯高于其它3 組，貯藏7 d 時黏度最大，最大黏度為1 140 mPa·s，在貯藏28 d 時黏度為1 000 mPa·s。添加Probio-M8 和PC-01 可顯著提高貯藏過程中發(fā)酵乳的黏度，從而改善產(chǎn)品品質(zhì)。

圖6 貯藏期間發(fā)酵乳黏度的變化Fig.6 Viscosity changes of fermented milk during storage

2.8 持水性的變化

貯藏期間發(fā)酵乳持水性的變化如圖7所示，發(fā)酵乳持水性的強弱與發(fā)酵乳的組織狀態(tài)有關(guān)，持水能力強，則發(fā)酵乳的組織狀態(tài)好，可以防止乳清析出。貯藏期間，添加益生菌的發(fā)酵乳持水性顯著升高（P<0.05），Probio-M8 組最高，平均持水性為54.5%±0.58%。研究表明添加益生菌Probio-M8和PC-01 有利于發(fā)酵乳產(chǎn)品凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有利于提高產(chǎn)品品質(zhì)。

圖7 貯藏期間發(fā)酵乳持水性的變化Fig.7 Water capacity of fermented milk during storage

3 結(jié)論

本文通過分析益生菌乳雙歧桿菌Probio-M8和/或副干酪乳桿菌PC-01 發(fā)酵乳在發(fā)酵及貯藏過程中的微流變特性、酸度、持水力、pH 值、活菌數(shù)和黏度的變化。研究表明添加乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 均可加快發(fā)酵乳的凝乳速度，同時縮短了發(fā)酵時間。添加益生菌后發(fā)酵乳凝膠具有較高的固液平衡值和較低的彈性因子，對微觀黏度因子和流動因子沒有影響。乳雙歧桿菌Probio-M8 和/或副干酪乳桿菌PC-01 在貯藏28 d 時的活菌數(shù)均大于107CFU/mL，具有良好穩(wěn)定性。貯藏期間添加益生菌的發(fā)酵乳pH 值和滴定酸度沒有顯著變化，但黏度和持水性顯著升高。因此，乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 應(yīng)用于發(fā)酵乳加工中具有良好的應(yīng)用前景。