于佳琪，楊婭楠，李轉(zhuǎn)羽，馬艷艷，趙柏聞*，吳崇明*

（1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193 2 北京量化健康科技有限公司 北京 100070）

高脂血癥（hyperlipemia）是指血脂水平過高，主要臨床表現(xiàn)為血液中膽固醇和/或甘油三酯水平異常增高，進而能夠引發(fā)一系列代謝性疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病和胰腺炎等，嚴(yán)重威脅人類的健康[1-5]。脂肪攝入過多，脂蛋白合成、代謝過程的異常，以及不良的飲食生活習(xí)慣均可導(dǎo)致血脂水平異常，導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)生[6-8]。近年來隨著人們生活水平的提高，脂肪能量攝入的增加，全世界高脂血癥的發(fā)病率大幅上升[9-10]，已成為重要的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有血脂異常患者高達4.3 億，形成龐大的心血管疾病和肝病高危群體[11]。

目前，臨床上已有多種降血脂藥物，雖然降脂療效比較顯著，但是長期使用會產(chǎn)生較明顯的副作用[12-16]。近年來一些腸道細菌對脂質(zhì)代謝的影響逐漸引起人們的注意[17-20]。加氏乳桿菌是一種在腸道中自然存在的天然益生菌，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理活性，包括抗炎，改善胰島素分泌，調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，治療肥胖癥，抗高膽固醇等[21-25]，然而加氏乳桿菌對高脂血癥的作用報道較少。本研究利用油酸誘導(dǎo)的HepG2 細胞脂質(zhì)堆積模型以及通過高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂血癥小鼠模型，探討加氏乳桿菌對脂質(zhì)堆積、脂質(zhì)代謝活性的影響，為開發(fā)以腸道菌為功能型產(chǎn)品以及尋找新的高脂血癥防治手段提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、細胞來源與實驗動物 菌株：各單菌株培養(yǎng)物上清液，由北京量化健康科技有限公司提供，用于體外實驗。加氏乳桿菌活菌（Lactobacillus gasseri-BDUP），由北京量化健康科技有限公司提供，用于動物體內(nèi)實驗。加氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌（Lactobacillus gasseri-ATCC 33323），中國普通微生物菌種保藏管理中心，用于動物體內(nèi)實驗。

細胞株：人肝癌HepG2 細胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。

實驗動物：8 周齡雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠32 只，北京華阜康生物科技股份有限公司。

飼料：①普通飼料；②高脂飼料（High Fat Diets，H10060），主要成分為：蛋白質(zhì)26.0%，糖類26.0%，脂肪35.0%，北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑、儀器和設(shè)備 高糖DMEM 培養(yǎng)基，康寧公司；胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶、雙抗、PBS，美國Thermo Fisher 公司；油酸、非諾貝特、DMSO、油紅O 粉末和Bodipy493/503 熒光染料，美國Sigma 公司；多聚甲醛，碧云天公司；BCA蛋白檢測試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；甘油三酯測定試劑盒，南京建成科技有限公司；NP-40，美國Biotopped 公司。細胞培養(yǎng)所用離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、槍頭等耗材，美國Thermo Fisher 公司。

動物試驗用總膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司。

多規(guī)格移液器，美國eppendorf 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；KC junior 微孔板掃描酶標(biāo)儀，美國BIOTEK 公司；超低溫冰箱，美國Thermo 公司；普通倒置光學(xué)顯微鏡，德國Leica 公司；細胞超聲破碎儀，美國Thermo 公司；高速冷凍離心機，美國Eppendorf 公司；全自動生化儀，美國Backman公司。

1.2 方法

1.2.1 加氏乳桿菌降低HepG2 細胞的脂質(zhì)堆積

1.2.1.1 細胞培養(yǎng) HepG2 細胞培養(yǎng)于含10%FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2，飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細胞生長至80%時，棄舊培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化，并傳代培養(yǎng)。

1.2.1.2 油紅O 染色 將對數(shù)生長期內(nèi)生長狀態(tài)良好的HepG2 細胞傳代，以適宜濃度均勻接種至96 孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL，待細胞生長匯合至80%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為100 μmol/L 油酸的70 μL DMEM 培養(yǎng)基，以加30%菌株培養(yǎng)基CK 為陰性對照，以20 μmol/L 非諾貝特為陽性對照，試驗組給予30 μL 菌株培養(yǎng)物上清液，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)基，PBS 緩沖液漂洗1 次，每孔加入40μL 的4%多聚甲醛，固定細胞30 min 后去除多聚甲醛固定液，PBS 漂洗1 次；加入35 μL 油紅O 染液室溫避光染色30 min 后，去除油紅O 染液并用PBS 漂洗2 次；每孔加入30 μL DMSO，置于搖床上避光輕搖5 min，用微孔板分光光度計在358 nm 處讀取吸光度。

1.2.1.3 Bodipy 熒光染色 將對數(shù)生長期內(nèi)生長狀態(tài)良好的HepG2 細胞傳代，以適宜濃度均勻接種至24 孔板中，每孔加入細胞懸液500 μL，待細胞生長匯合至80%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為100 μmol/L 油酸的350 μL DMEM 培養(yǎng)基，以加30%加氏乳桿菌培養(yǎng)基CK 為陰性對照，以20 μmol/L 非諾貝特為陽性對照，試驗組給予150 μL 加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原有培養(yǎng)基，PBS 緩沖液漂洗1 次，每孔加入500 μL 的4%多聚甲醛，固定細胞30 min 后去除多聚甲醛固定液，PBS 漂洗1 次；加入提前配制好的Bodipy 染液500 μL，室溫避光孵育30 min 后去除染液，并用PBS 漂洗2 次，使用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.1.4 甘油三酯濃度測定 將對數(shù)生長期內(nèi)生長狀態(tài)良好的HepG2 細胞傳代，以適宜濃度均勻接種至12 孔板中，每孔加入細胞懸液1 mL，待細胞生長匯合至80%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為100 μmol/L 油酸的700 μL DMEM 培養(yǎng)基，以加30%加氏乳桿菌培養(yǎng)基CK 為陰性對照，以20 μmol/L 非諾貝特為陽性對照，試驗組給予300 μL 加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)基，PBS緩沖液漂洗1 次，每孔加入500 μL PBS 收集細胞至1.5 mL EP 管中，離心后去上清液，每管加入300 μL A 液（5% NP-40+95% ddH2O）。根據(jù)甘油三酯測定試劑盒檢測甘油三酯含量，按照BCA蛋白定量試劑盒說明檢測蛋白含量，計算甘油三酯濃度 （甘油三酯濃度=甘油三酯含量/蛋白含量）。

1.2.2 加氏乳桿菌對高脂血癥小鼠的降脂作用

1.2.2.1 實驗動物分組 32 只小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF 級動物房，按照實驗動物飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)，先經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，觀察其體重以及一般情況的變化。隨后將小鼠按照體質(zhì)量隨機分為4 組：正常對照組、模型對照組、加氏乳桿菌ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株組（ATCC）、加氏乳桿菌BDUP 菌株組（BDUP）。每組8 只，正常對照組小鼠喂食普通飼料；模型對照組小鼠喂食高脂飼料，每天灌胃加氏乳桿菌培養(yǎng)基；加氏乳桿菌組喂食高脂飼料，分別每天灌胃109CFU/d 的加氏乳桿菌活菌。持續(xù)4 周，所有組小鼠每周記錄1次體質(zhì)量與飼料攝取質(zhì)量，每天觀察小鼠生長狀態(tài)。試驗結(jié)束后，摘除眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取脂肪組織（腹后壁脂肪、附睪脂肪）和肝臟組織，電子天平稱取脂肪組織質(zhì)量，將肝臟組織均液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中凍存。

1.2.2.2 指標(biāo)檢測 血液經(jīng)2 500 r/min 離心后取上清，通過半自動生化分析儀檢測小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)：血清總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、甘油三酯（TG）。

肝臟組織經(jīng)勻漿，13 000 r/min 離心5 min 后取上清，根據(jù)試劑盒說明書測定小鼠肝脂相關(guān)指標(biāo)：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），樣本比較采用方差檢驗，各數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示。*P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選具有降脂活性的加氏乳桿菌

利用油酸誘導(dǎo)建立的HepG2 細胞脂質(zhì)堆積模型，對166 株加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液的降脂活性進行檢測。3 次及以上油紅O 染色法篩選的結(jié)果顯示：166 株加氏乳桿菌的調(diào)脂能力位于降低34.05%到升高15.66%之間。其中有61 株使脂質(zhì)積累降低10%以上，64 株的降脂能力在（-10%～0）之間，而36 株菌使脂質(zhì)積累略微增加，有5 株反而使脂質(zhì)積累增加超過10%（表1）。整體上，166 株加氏乳桿菌中有61 株顯示出顯著的降脂效果，比例達36.75%。另外，有5 株具有較強的升脂作用，其余100 株對脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用無明顯作用。其中BDUP 菌株具有最強的降脂活性，藥效穩(wěn)定且培養(yǎng)性最好，對其進行大量發(fā)酵并在動物體內(nèi)進行降脂功效研究。

表1 加氏乳桿菌調(diào)脂作用篩選結(jié)果Table 1 Screening results for the lipid-modulatory efficiency of L.gasseri srains

2.2 加氏乳桿菌降低油酸誘導(dǎo)的HepG2 細胞中脂質(zhì)堆積和甘油三酯含量

利用油酸誘導(dǎo)建立的HepG2 細胞脂質(zhì)堆積模型，對上述最優(yōu)的加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液的降脂活性進行檢測。通過Bodipy 熒光染色觀察，結(jié)果表明，與模型組NC 相比，加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液組的熒光信號所有下降，與陽性藥非諾貝特處理相似（圖1a），在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性（圖1b）。這說明加氏乳桿菌能夠顯著抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細胞脂質(zhì)堆積。

圖1 通過Bodipy493/503 熒光染色觀察加氏乳桿菌對HepG2 細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響（n=8）Fig.1 Effect of L.gasseri on intracellular lipid accumulation in HepG2 cells with Bodipy493/503 （n=8）

為了進一步確認(rèn)加氏乳桿菌對HepG2 細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響，進行油紅O 染色定量分析，結(jié)果顯示，與模型組NC 相比，陽性藥和加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液都能抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細胞脂質(zhì)堆積，結(jié)果具有顯著差異（圖2a）。定量試劑盒檢測HepG2 細胞中甘油三酯含量（圖2b），與模型組NC 相比，加氏乳桿菌組細胞中甘油三酯含量明顯下降（P＜0.01），且加氏乳桿菌的作用效果優(yōu)于陽性藥非諾貝特的作用效果。

圖2 加氏乳桿菌對HepG2 細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積及甘油三酯含量的影響（n=4）量分析結(jié)果Fig.2 Effect of L.gasseri on intracellular lipid accumulation and intracellular content of triglycerides in HepG2 cells （n=4）

2.3 加氏乳桿菌改善高脂血癥小鼠的脂質(zhì)異常

為了確定加氏乳桿菌在體內(nèi)是否具有改善脂質(zhì)活性作用，對C57BL/6J 小鼠喂食高脂飼料來建立高脂血癥小鼠模型，并灌胃加氏乳桿菌4 周。由圖3a 可知，試驗前4 組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，4周后模型對照組小鼠體質(zhì)量與空白對照組相比顯著增加，加氏乳桿菌能夠顯著降低高脂血癥小鼠的體質(zhì)量，無論是商品化標(biāo)準(zhǔn)加氏乳桿菌還是本試驗前期在細胞體外發(fā)現(xiàn)具有顯著降脂活性的加氏乳桿菌樣品，均使小鼠體重恢復(fù)到正常對照組的水平（圖3a）。4 組小鼠的體質(zhì)量增加量趨勢一致（圖3b）。此外，通過比較加氏乳桿菌組和模型對照組小鼠各部位脂肪質(zhì)量的變化，發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌明顯降低了高脂血癥小鼠的腹后壁脂肪和附睪脂肪質(zhì)量（圖3c）。

圖3 加氏乳桿菌對高脂血癥小鼠體重和脂肪質(zhì)量的影響（n=8）Fig.3 Effects of L.gasseri on body weight and fat weight in hyperlipidemic mice （n=8）

針對高脂血癥會導(dǎo)致的血脂水平變化，檢測了小鼠的血脂水平。與空白對照組相比，模型組小鼠血清的總膽固醇 （TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）和甘油三酯（TG）水平均有顯著的升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明高脂飲食導(dǎo)致小鼠血脂水平異常。灌胃加氏乳桿菌4 周后，小鼠血清中TC、LDL-c 和TG 水平顯著降低，而高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯變化 （圖4a）。值得注意的是，加氏乳桿菌活菌（L.gasseri-BDUP）的降血脂作用優(yōu)于商品化標(biāo)準(zhǔn)加氏乳桿菌 （L.gasseri-ATCC 33323）的作用。

最后對高脂血癥小鼠肝臟脂質(zhì)水平進行檢測。如圖4b 所示，高脂飼料喂養(yǎng)后小鼠的肝脂水平明顯升高，尤其是甘油三酯（TG）水平，而L.gasseri-BDUP 能夠顯著降低肝臟組織中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4b）。然而，L.gasseri-ATCC 33323 僅能降低高脂血癥小鼠肝臟組織中甘油三酯水平，對總膽固醇無顯著影響。與血脂水平數(shù)據(jù)一致，與L.gasseri-ATCC 33323 相比，L.gasseri-BDUP 降低肝臟脂質(zhì)水平的能力更強。這些結(jié)果說明加氏乳桿菌L.gasseri-BDUP 能夠降低高脂血癥小鼠的肝臟脂質(zhì)水平，改善脂質(zhì)異常，具有良好的體內(nèi)抗高脂血癥的功效。

圖4 加氏乳桿菌對高脂血癥小鼠血脂和肝脂水平的影響（n=8）Fig.4 Effects of L.gasseri on blood lipid and liver lipid metabolic activity in hyperlipidemic mice （n=8）

3 討論與結(jié)論

近年來，越來越多的研究表明，腸道菌群作為宿主體內(nèi)的一種寄生共存物，在人體健康中發(fā)揮著不可或缺的作用，它們的組成、活性、產(chǎn)生的代謝物等均會影響人體的生理病理狀態(tài)。腸道菌群可以改善高脂飲食小鼠的葡萄糖和脂質(zhì)代謝[26]，從而在肥胖、高脂血癥[27]、糖尿病、動脈粥樣硬化[28]等疾病中發(fā)揮重要作用。從腸道菌群中篩選具有降脂功效的菌株將促進對多種疾病的診斷和治療。

益生菌作為腸道菌群的一部分，具有保護腸道黏膜屏障，調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。而加氏乳桿菌是在腸道中自然存在的一種天然益生菌，研究發(fā)現(xiàn)，加氏乳桿菌可以通過影響長鏈酰CoA 合成酶3（ACSL3）的表達及脂肪酸感應(yīng)途徑進一步調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[24]；還可以通過增強炎性免疫反應(yīng)，抑制食欲來改善大鼠代謝特征[29]。不僅如此，加氏乳桿菌具有改善腸道完整性，減少脂多糖（LPS）等炎癥物質(zhì)的侵襲，降低脂肪組織炎癥的作用[30]，因此對治療肥胖癥有良好的效果[23]。

本試驗基于加氏乳桿菌在降脂方面的良好作用，篩選腸道菌群中具有降脂活性的菌株，結(jié)果顯示，篩選的166 株加氏乳桿菌中，有61 株顯示出顯著的降脂效果，其中BDUP 菌株具有最強的降脂效力。體外試驗結(jié)果表明，加氏乳桿菌BDUP 菌株對油酸誘導(dǎo)的HepG2 細胞脂質(zhì)堆積有明顯的改善作用，其效果甚至優(yōu)于陽性藥非諾貝特。Bodipy 熒光染色結(jié)果顯示，與模型組相比，加氏乳桿菌BDUP 菌株培養(yǎng)物上清液組的熒光信號有所下降，與陽性藥組接近。另外，與模型組相比，加氏乳桿菌BDUP 菌株組細胞中甘油三酯含量也明顯下降。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，加氏乳桿菌能夠顯著降低高脂血癥小鼠的體質(zhì)量，無論是加氏乳桿菌標(biāo)菌ATCC 33323 還是本試驗篩選的具有顯著降脂活性的加氏乳桿菌BDUP 樣品，均能使小鼠體質(zhì)量恢復(fù)到正常對照組的水平。此外，通過比較加氏乳桿菌組和模型對照組，發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌明顯降低高脂血癥小鼠的腹后壁脂肪和附睪脂肪質(zhì)量。與模型組相比，小鼠血清中的TC、LDL-c 和TG 水平顯著降低，肝臟組織中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量也顯著降低，且試驗篩選所得加氏乳桿菌BDUP 的作用更優(yōu)于加氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 33323。

總之，本試驗結(jié)果表明，益生菌加氏乳桿菌在體外和體內(nèi)均有良好的降脂作用，篩選的BDUP菌株比標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33323 在降脂方面具有更明顯的優(yōu)勢。這些菌株可以改善肥胖癥、高脂血癥等疾病中的脂質(zhì)代謝紊亂，在代謝性疾病的預(yù)防和改善中具有重要作用。研究結(jié)果為開發(fā)以加氏乳桿菌BDUP 為主的降脂功能性產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。后續(xù)還需對加氏乳桿菌發(fā)揮降脂功效的作用機制進行探究，通過揭示其機理，為高脂血癥研究提供新的思路。