范 瑞，劉彥品，趙軍英，劉 斌，劉 茜，高子晴*，陳歷俊*

（1 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 遼寧大連 116034 2 北京三元食品股份有限公司 國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心北京市乳品工程技術(shù)研究中心 母嬰研究技術(shù)創(chuàng)新中心 北京 100163）

孕產(chǎn)期女性受激素等因素影響，其身體和心理發(fā)生重大變化[1]。母乳是嬰幼兒最理想的食物來源，母乳成分受母親膳食影響。臨床研究發(fā)現(xiàn)母體在孕期補(bǔ)充乳酸雙歧桿菌動(dòng)物菌株HNO19，可以在初乳和3 個(gè)月的母乳中檢測(cè)到同株菌[2]。母乳中的微生物可以傳遞給嬰兒，如雙歧桿菌、乳酸桿菌等，可抑制病原微生物在嬰兒腸道內(nèi)生長(zhǎng)定植，促進(jìn)嬰兒腸道微生態(tài)健康[3-6]。純母乳喂養(yǎng)方式下，母乳中蛋白質(zhì)、脂肪等主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量可能直接影響嬰幼兒早期生長(zhǎng)發(fā)育[7]，母乳里的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)2～12 周的嬰幼兒的生長(zhǎng)速率[8]。有研究表明膳食干預(yù)會(huì)影響母乳中的脂肪、干物質(zhì)和總能量[9]。然而，由于膳食干預(yù)對(duì)母乳成分的影響不顯著，使用益生菌干預(yù)母乳成分逐漸成為學(xué)者們爭(zhēng)相探究的課題。

益生菌是指活的微生物，當(dāng)量足夠大時(shí)，會(huì)賦予宿主健康益處。有研究以肥胖大鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌及短雙歧桿菌均能一定程度上改善肥胖大鼠的肥胖指數(shù)、血脂紊亂及胰島素抵抗[10]。Park 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌HAC01 通過調(diào)節(jié)毛羅菌科和瘤胃菌科，減輕肥胖小鼠脂肪堆積，上調(diào)脂質(zhì)氧化相關(guān)基因的表達(dá)。此外，臨床研究也顯示，益生菌能有效調(diào)節(jié)肥胖患者的體質(zhì)量，嗜黏蛋白阿克曼氏菌能夠改善腸道屏障功能，調(diào)節(jié)高脂飲食相關(guān)的代謝紊亂，如體重增加、代謝性內(nèi)毒素血癥、脂肪組織炎癥及胰島素抵抗等[12]。對(duì)于嬰幼兒而言，母親孕期增重過多也可能導(dǎo)致學(xué)齡前兒童發(fā)生超重或肥胖[13]。益生元的最新定義為：一種可以被宿主微生物選擇性利用，從而賦予健康益處的基質(zhì)[14]，包括低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉等[15]。目前常見的益生元包括乳果糖、低聚果糖。益生元能夠增加飽腹感和降低食欲[16]，能夠被人體腸道益生菌發(fā)酵利用，增加原籍益生菌，遏制有害菌，減低機(jī)體炎癥狀態(tài)，改善糖脂代謝，調(diào)節(jié)腸道激素變化，從而改善肥胖及肥胖相關(guān)代謝紊亂[17]，是超重或肥胖人群控制體重的理想選擇。

抑郁癥是當(dāng)今世界最常見的精神障礙，具有顯著持久的心境低落、興趣減退和快感缺失等臨床特征[18]，在全球的發(fā)生率高達(dá)10%～30%[19]。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后抑郁和嬰幼兒心理行為發(fā)育的關(guān)系呈正比[20]，對(duì)嬰兒體格發(fā)育和發(fā)育商有負(fù)面影響的可能[21]。另外，產(chǎn)后抑郁還是嬰幼兒社會(huì)情緒能力發(fā)展不良的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[22]。為了提高產(chǎn)后母子精神健康水平，研究人員們發(fā)現(xiàn)給予幼年大鼠益生菌，能夠改善親子分離應(yīng)激模型小鼠抑郁癥狀，且有益效應(yīng)延續(xù)到小鼠成年以后，用益生菌調(diào)節(jié)胃腸功能同樣能改善臨床患者的抑郁癥狀[23-24]。瑞士乳桿菌R0052 和長(zhǎng)雙岐桿菌R0175 也可以改善抑郁焦慮癥狀[25]。此外，有證據(jù)證明益生元通過推動(dòng)有益微生物的生長(zhǎng)，改善焦慮、抑郁癥狀[26]。

有關(guān)益生菌、益生元對(duì)超重肥胖孕婦的影響已有部分報(bào)道，然而，不同菌株或其組合與代謝物具有不同功效，目前缺少益生菌孕產(chǎn)期干預(yù)對(duì)母子健康功效的研究。本文探究既富含益生菌，又富含益生元的發(fā)酵乳對(duì)母乳成分、母子身體和心理健康水平的影響。

1 材料與方法

1.1 受試者納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～35 歲；單胎妊娠；入組孕周8～12 周零6 天 （根據(jù)末次月經(jīng)或B 超監(jiān)測(cè)）；BMI≥25 kg/m2，在京居住至少5年，無孕前高血壓、糖尿病、高脂血癥、肝炎、腎炎、消化道疾?。晕秆住⒛c炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等）及感染性疾病史（肝炎、肺結(jié)核等）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：近1 個(gè)月服用抗生素、益生菌或益生元，規(guī)律吸煙、飲酒，輔助生育技術(shù)受孕，精神類疾病不能正確回答問題或不愿進(jìn)行問卷調(diào)查者不納入本研究；減肥手術(shù)史；不能依從膳食推薦；乳糖不耐受；牛奶蛋白過敏。

1.2 受試者招募、干預(yù)與跟蹤

招募Y（發(fā)酵乳組）84、C（對(duì)照組）62 名受試者（產(chǎn)婦），研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017-KY-015-02），所有志愿者簽署知情同意書，每日飲用一瓶富含益生菌益生元的衡安堂166 發(fā)酵乳（簡(jiǎn)稱166 發(fā)酵乳）200 mL。166 發(fā)酵乳配料如下：生牛乳、菊粉（1%～2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、低聚果糖（1%～2%）、聚葡萄糖（≤1%）、低聚異麥芽糖（≤1%）、低聚半乳糖（1%～2%）、低聚木糖（≤1%）、甜菊糖苷、羅漢果甜苷、格氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、短雙岐桿菌（Bifidobacterium breve）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactobacillus）、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）。

分別在產(chǎn)后1～5 d，42±3 d，3～6 個(gè)月收集采集母乳；產(chǎn)后42 d 收集母嬰健康隨訪表、嬰幼兒神經(jīng)心理評(píng)估量表ASQ-3、愛丁堡產(chǎn)后抑郁量表（Edinburgh Postnatal Depression Scale，EPDS）。母乳采集方法：用香皂或洗手液洗凈雙手，并用干凈的濕巾輕輕擦拭乳頭及乳暈，上午9：00-11：00 用消毒后的吸奶器吸空一側(cè)乳房乳汁，將前乳和后乳混勻后取10 毫升于無菌的離心管中，采集后暫時(shí)存放在-20 ℃冰箱中，24 h 內(nèi)低溫轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱。受疫情影響，各階段有部分受試者退組以及個(gè)別信息缺填情況。由于初乳采集量較少，而母乳成分和微生物分析樣本用量較高，因此沒有對(duì)初乳進(jìn)行檢測(cè)與分析；產(chǎn)后6 周內(nèi)是抑郁癥的高發(fā)期[27]，以產(chǎn)后42 d 為代表分析發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后近期母嬰健康、產(chǎn)婦抑郁、嬰幼兒神經(jīng)心理發(fā)育的影響。各階段采集的樣本數(shù)量及量表收集數(shù)量見表1。

表1 樣本及量表采集數(shù)量Table 1 Number of collected samples and scales

1.3 樣本檢測(cè)和健康評(píng)估量表

母乳微生物檢測(cè)：采用CTAB 或SDS 法提取母乳樣本基因組DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的濃度和純度，然后對(duì)母乳菌群16S rRNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為515F-806R，位于16S V4 區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物由2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后使用Qiagen 公司提供的膠回收試劑盒進(jìn)行純化，利用Illumina 公司TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好文庫(kù)后，通過Qubit 和Q-PCR 定量，最后通過NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

母乳宏量成分檢測(cè)：首先使用3 mL 加熱至40 ℃的CLEAN 液對(duì)Miris HMA 母乳分析儀進(jìn)行清洗，注入3 mL 的CHECK 液進(jìn)行指標(biāo)校正。接著使用離心管取3～5 mL 的母乳樣本進(jìn)行超聲，再使用5 mL 規(guī)格注射器將樣本注入母乳分析儀中，檢測(cè)完成之后進(jìn)行儀器清洗，防止影響下次使用。

母子健康指標(biāo)：母親身體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）、嬰幼兒體重增長(zhǎng)指標(biāo)，通過愛丁堡產(chǎn)后抑郁量表、嬰幼兒神經(jīng)心理評(píng)估量表ASQ-3 分別評(píng)估產(chǎn)婦、嬰幼兒神經(jīng)心理發(fā)育狀況。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)比兩組母親的身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、愛丁堡產(chǎn)后抑郁量表（EPDS）得分等指標(biāo)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理以及圖表繪制：SPSS，Oringin 等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)母乳菌群相對(duì)豐度的影響

從圖1可以看出，在屬水平上，對(duì)照組在產(chǎn)后42 d 以不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）為優(yōu)勢(shì)菌屬；發(fā)酵乳組以不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）為優(yōu)勢(shì)菌屬。在產(chǎn)后3～6 個(gè)月，對(duì)照組以不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬；發(fā)酵乳組以不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖1 發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后42 d，3～6 個(gè)月母乳菌群屬水平上相對(duì)豐度的影響Fig.1 Effect of fermented dairy intervention on the relative abundance of breast milk flora at genus level on postpartum 42 days and 3-6 months

2.2 發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)母乳菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

圖2顯示，在產(chǎn)后42 d，母乳菌群的群落構(gòu)成具有顯著差異 （P=0.001），且發(fā)酵乳組逐漸沿著PCo2（貢獻(xiàn)率9.8%）拉開距離，同時(shí)也說明存在造成這種顯著差異的關(guān)鍵菌屬；在產(chǎn)后3～6 個(gè)月，發(fā)酵乳組和對(duì)照組的母乳微生物存在部分重合（P=0.885）。即發(fā)酵乳干預(yù)可以顯著改變產(chǎn)后42 d 母乳微生物菌群的整體結(jié)構(gòu)。

圖2 PCoA 分析Fig.2 PCoA analysis

2.3 發(fā)酵乳組和對(duì)照組的差異菌屬分析

將發(fā)酵乳組和對(duì)照組產(chǎn)后42 d、3～6 個(gè)月的母乳微生物比較發(fā)現(xiàn)，在屬的水平上，與對(duì)照組相比，產(chǎn)后42 d 發(fā)酵乳組的羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、細(xì)球菌屬（Micrococcaceae）顯著上升；韋榮氏球菌屬（Veillonella）、痤瘡丙酸桿菌（Cutibacterium）、鏈球菌屬、泛菌屬（Pantoea）、兼性雙球菌屬（Gemella）、羅斯氏菌屬 （Rothia）、奈瑟氏菌屬（Neisseria）等菌屬顯著下降（P＜0.05）（圖3a）。在產(chǎn)后3～6 個(gè)月，經(jīng)過發(fā)酵乳干預(yù)后，母乳中的細(xì)球菌屬、大腸志賀氏桿菌（Escherichia-Shigella）、罕見小球菌屬顯著上升；鏈球菌屬顯著下降（P＜0.05）（圖3b）。

圖3 母乳微生物的差異菌屬分析Fig.3 Differential bacteria analysis on dominant genus

2.4 發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)母乳宏量成分的影響

根據(jù)發(fā)酵乳組和對(duì)照組在產(chǎn)后42 d 和產(chǎn)后3～6 個(gè)月兩組母乳中的宏量成分比較分析，發(fā)現(xiàn)在脂肪、總蛋白、真蛋白、糖類、干物質(zhì)以及總能量中，僅產(chǎn)后3～6 個(gè)月時(shí)，發(fā)酵乳組母乳中的真蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P=0.033），其它宏量成分在兩組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。

圖4 發(fā)酵乳干預(yù)母乳中的宏量成分Fig.4 Effect of fermented dairy on breast milk macronutrient

2.5 發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后母子體重、心理健康及嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育的影響

根據(jù)發(fā)酵乳組和對(duì)照組在產(chǎn)后1～5 d，產(chǎn)后42 d 以及產(chǎn)后3～6 個(gè)月母親的身體質(zhì)量指數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩組的母親身體質(zhì)量指數(shù)在產(chǎn)后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖5a，5b，5c）。圖5d 同樣顯示在產(chǎn)后1～5 d，產(chǎn)后42 d 以及產(chǎn)后3～6 個(gè)月嬰幼兒的體重增長(zhǎng)在兩組中無顯著差異 （P＞0.05）。

圖5 發(fā)酵乳干預(yù)產(chǎn)后母子身體質(zhì)量指數(shù)和體重Fig.5 Effect of fermented dairy on mother and child's increased body mass index and weight

發(fā)酵乳組和對(duì)照組產(chǎn)婦在產(chǎn)后42 d 愛丁堡抑郁量表平均得分分別為5.87 和5.80 分（圖6）。發(fā)酵乳組有四分之一的人得分超過10 分，有四分之一的人得分低于1.25 分，有一半的人得分是在1.25 和10 分之間；均值高于中位數(shù)，說明分值右偏。對(duì)照組有四分之一的人得分超過7.4 分，有四分之一的人得分低于2.4 分，有一半的人得分在2.4～7.4 分之間；均值高于中位數(shù)，說明分值右偏。發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后抑郁沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖7顯示發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后42 d 的嬰幼兒精細(xì)動(dòng)作僅具有10%水平上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，另外發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后42 d 嬰幼兒的溝通、粗大動(dòng)作、解決問題、個(gè)人-社會(huì)方面的影響不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖6 發(fā)酵乳干預(yù)產(chǎn)后42 d 愛丁堡抑郁量表得分Fig.6 Effect of fermented dairy on scores of Edinburgh postnatal depression scale during the puerperium

圖7 發(fā)酵乳干預(yù)產(chǎn)后42 d 嬰幼兒ASQ-3Fig.7 Effect of fermented dairy on ASQ-3 for infants during the puerperium

3 討論

本次臨床實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)和解析受試人群產(chǎn)后兩個(gè)階段的母乳發(fā)現(xiàn)，富含益生菌益生元的發(fā)酵乳對(duì)母乳微生物的結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用。在產(chǎn)后42 d，發(fā)酵乳組的痤瘡丙酸桿菌、羅斯氏菌、奈瑟氏菌屬顯著減少，痤瘡丙酸桿菌通過表達(dá)蛋白酶，使受體、TNF-α、TLR 活化，激活先天性免疫反應(yīng)以及角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-8/12/1、基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致毛囊皮脂腺角化過度[28]。羅斯氏菌可能會(huì)導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)生[29]，奈瑟氏菌屬與胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[30]。另外，不論是在產(chǎn)后42 d，還是產(chǎn)后3～6個(gè)月，酸奶組中的鏈球菌屬相對(duì)豐度均顯著下降，有研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬屬于“促癌菌”，該菌可以通過抑制免疫，從而刺激促炎細(xì)胞因子的釋放，或者直接與癌細(xì)胞互作，刺激癌細(xì)胞增殖[31]。本項(xiàng)研究表明發(fā)酵乳干預(yù)對(duì)產(chǎn)后3～6 個(gè)月的母乳中的真蛋白具有顯著促進(jìn)作用。真蛋白包括α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶等，α-乳白蛋白具有調(diào)節(jié)乳糖合成及乳汁分泌的作用[32]，乳鐵蛋白可抗真菌、抗病毒、抗氧化等[33]，溶菌酶具有增強(qiáng)新生兒抗感染能力的作用[34]，研究表明真蛋白的合成主要受到乳腺代謝通路的影響，受膳食作用較小。因此，發(fā)酵乳干預(yù)是否改善了乳腺的代謝通路，以及干預(yù)母乳微生物和宏量成分的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，發(fā)酵乳組在ASQ-3 溝通、粗大動(dòng)作、解決問題等方面不具有顯著差異性，這主要是因?yàn)閶雰旱纳窠?jīng)心理發(fā)育受到多種因素的影響。因此，本研究說明富含益生菌益生元的發(fā)酵乳通過調(diào)整母乳的菌群結(jié)構(gòu)、宏量成分等營(yíng)養(yǎng)組成，具有提高嬰幼兒神經(jīng)心理發(fā)育的潛在作用，具有一定的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和前景。