李紫瀅，楊 夢(mèng)，陳志雄，劉嘉麗，管 燕,胡 蓉,楊 通，楊云慧

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

納米結(jié)構(gòu)是指在維度上至少有一個(gè)維度處于納米級(jí)(1～100 nm)，或者是以納米級(jí)的材料作為基本單元而存在的材料，金納米結(jié)構(gòu)基于其獨(dú)特的性質(zhì)被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的最佳選擇。常見(jiàn)的金納米結(jié)構(gòu)有金納米簇[1]、金納米球[2]、金納米棒[3]、金納米線(xiàn)[4]、金納米雙錐[5]、金納米片[6]、金納米籠、金納米立方體[7]、金納米星[8]和金納米花等。在分析化學(xué)領(lǐng)域，金納米結(jié)構(gòu)由于其較小的尺寸、良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，可作為優(yōu)良的光學(xué)探針應(yīng)用于生化傳感和光學(xué)成像[9]等領(lǐng)域。其中局域表面等離子共振性質(zhì)(localized surface plasmon resonance, LSPR)是金納米結(jié)構(gòu)重要的光學(xué)性質(zhì)之一，當(dāng)一定頻率的光照射到尺寸遠(yuǎn)小于光的波長(zhǎng)的金屬納米粒子表面時(shí)，如果入射光子頻率與金屬納米粒子的表面?zhèn)鲗?dǎo)電子產(chǎn)生的集體振蕩頻率相同，電子和光子在金屬納米粒子的表面的局部區(qū)域發(fā)生劇烈的共振，此現(xiàn)象稱(chēng)為L(zhǎng)SPR性質(zhì)。金屬納米粒子的LSPR性質(zhì)與它自身元素成分以及形狀、尺寸大小還有外界的介質(zhì)微環(huán)境等因素有很大的關(guān)系。由于金納米結(jié)構(gòu)在可見(jiàn)或近紅外區(qū)域有明顯的LSPR峰，可用比色分析法來(lái)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量或者定性分析。目前，基于納米結(jié)構(gòu)的可視化分析策略主要集中在以下幾個(gè)方面：(1)當(dāng)金納米結(jié)構(gòu)處于小尺寸時(shí)，約在2 nm以?xún)?nèi)，其以納米簇的形式存在，不具有明顯的吸收特性，但金納米簇都具有熒光性質(zhì)。目前基于金納米簇的光學(xué)分析以熒光分析為主，通過(guò)熒光猝滅的作用也可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物的可視化分析檢測(cè)，例如：Yang等合成了一種賴(lài)氨酸穩(wěn)定的金納米簇和牛血清蛋白穩(wěn)定的金納米簇的混合溶液用于Cu2+的高靈敏檢測(cè)，當(dāng)Cu2+存在時(shí)，熒光很容易被猝滅[10]。(2)金納米球狀顆粒的團(tuán)聚使得溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，即金納米結(jié)構(gòu)間的距離比平均粒徑大時(shí)，金納米結(jié)構(gòu)就處于分散的狀態(tài)，此時(shí)溶液為紅色；當(dāng)分析物存在時(shí)，導(dǎo)致金納米結(jié)構(gòu)間的間距小于平均粒徑時(shí)，金納米則處于聚集狀態(tài)，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色[11]。(3)針對(duì)于金納米棒和金納米雙錐等納米結(jié)構(gòu)，因具有縱向和橫向等離子體吸收的光學(xué)特性，可以通過(guò)腐蝕或者Ag+沉積的方式誘導(dǎo)其膠體溶液顏色發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的可視化檢測(cè)[12]，比如在金納米結(jié)構(gòu)表面沉積Ag，會(huì)導(dǎo)致其LSPR峰發(fā)生藍(lán)移?；谠撛韺?duì)目標(biāo)物的比色分析可以在一定程度上避免金納米結(jié)構(gòu)的自團(tuán)聚造成的“假陽(yáng)性”的結(jié)果。(4)由于金納米結(jié)構(gòu)獨(dú)特的散射特性與材料本身以及周?chē)橘|(zhì)環(huán)境有密切的關(guān)系，因此，可以利用暗場(chǎng)散射分析法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)分析。相比于前面的比色法，暗場(chǎng)散射分析法可以在單個(gè)納米粒子水平對(duì)目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析。

基于以上的性質(zhì)，金納米結(jié)構(gòu)在化學(xué)和生物傳感方面得到了廣泛的應(yīng)用，本文綜述了金納米結(jié)構(gòu)作為光學(xué)探針在生物和化學(xué)傳感方面的應(yīng)用，主要介紹了金納米結(jié)構(gòu)在重金屬離子、食品有毒物質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物、生物毒素以及核酸檢測(cè)等方面的應(yīng)用，并對(duì)金納米結(jié)構(gòu)未來(lái)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 在化學(xué)傳感中的應(yīng)用

1.1 重離子的檢測(cè)

Hg2+可通過(guò)食物鏈在人體重要器官中積累，可引起腦損傷、腎功能衰竭等慢性疾病。對(duì)水和食品資源中的Hg2+進(jìn)行高選擇性、靈敏、廉價(jià)、簡(jiǎn)便的監(jiān)測(cè)對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品安全至關(guān)重要。Zohora等[13]利用肉桂葉提取物合成具有可控光學(xué)性質(zhì)的金納米顆粒對(duì)汞離子進(jìn)行快速比色檢測(cè)。Miyake等報(bào)道Hg2+可以與DNA的兩個(gè)胸腺嘧啶(T)相互作用，形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T，具有高度選擇性，這種基于DNA結(jié)構(gòu)的傳感器能夠選擇性地檢測(cè)水相中的Hg2+。但是這種方法，靈敏度相對(duì)較低[14]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，2017年，Yu等[15]設(shè)計(jì)了一種用于Hg2+檢測(cè)的比色/熒光雙模生物傳感器，使用熒光染料標(biāo)記的DNA發(fā)夾進(jìn)行雜交連鎖反應(yīng)(hybridization chain reaction,HCR)，可以極大地提高檢測(cè)的靈敏度。該研究最大的特色是：通過(guò)比色法可以用肉眼直接觀(guān)測(cè)測(cè)定結(jié)果，而熒光檢測(cè)可以在更廣的鹽濃度范圍內(nèi)進(jìn)行，對(duì)工業(yè)廢水的一般環(huán)境分析和評(píng)價(jià)具有良好的潛力。

圖1 超靈敏檢測(cè)Hg2+的比色/熒光雙模傳感器的工作原理[15]

1.2 食品中有毒物質(zhì)的檢測(cè)

三聚氰胺是一種富含氮的化學(xué)物質(zhì)，在2008年，中國(guó)發(fā)生三聚氰胺奶粉事件以后，三聚氰胺越來(lái)越受到人們的關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法都需要專(zhuān)業(yè)的操作人員且成本較高。因此，需要尋找一種可以快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)三聚氰胺方法。Cao等[16]建立了一種檢測(cè)三聚氰胺的比色法。通過(guò)將相應(yīng)的金屬陽(yáng)離子(Au3+)與還原劑3,5-二羥基苯甲酸混合，實(shí)現(xiàn)了金納米粒子在水中的一步合成，添加三聚氰胺后，3,5-二羥基苯甲酸與三聚氰胺發(fā)生強(qiáng)氫鍵相互作用。因此，金納米顆粒的形成被三聚氰胺打斷。由于沒(méi)有足夠的還原劑來(lái)還原Au3+離子。當(dāng)三聚氰胺濃度增加時(shí)，溶液顏色會(huì)由紫色變成黃綠色。該方法可以對(duì)三聚氰胺進(jìn)行簡(jiǎn)單、高效的識(shí)別和定量。根據(jù)形成的金納米顆粒(Au NPs)的顏色變化，可以直接監(jiān)測(cè)三聚氰胺的濃度。2015年，Yin報(bào)道了一種基于H2O2-Au NPs快速靈敏比色法用于檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺[17]。用過(guò)氧化氫快速還原金離子，生成準(zhǔn)球形非聚集Au NPs，得到紅色溶液。當(dāng)有三聚氰胺時(shí)，H2O2可以與三聚氰胺反應(yīng)，生成穩(wěn)定的化合物。隨著過(guò)氧化氫的消耗，Au NPs的生長(zhǎng)速度減慢，導(dǎo)致Au NPs聚合形成藍(lán)色溶液，其檢測(cè)原理見(jiàn)圖2。這種方法的可以檢測(cè)低于 20 μM的三聚氰胺，檢測(cè)限為0.4 μM。

圖2 基于H2O2-Au NPs快速檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的示意圖[17]

2017年，Chen等[18]利用海膽型金納米作為探針，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、快速、有選擇性的三聚氰胺檢測(cè)?；诮鸺{米海膽的聚集，在pH值為5.72時(shí)對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)，這種方法的線(xiàn)性范圍約為0.1～1 μM,檢測(cè)限為18 nM。2018年，Hu等[19]提出了一種基于適體修飾的Au NPs的比色方法，這種方法簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高，適用于微量樣品中三聚氰胺的檢測(cè)。

2 在生物傳感中的應(yīng)用

2.1 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)

人甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)已被廣泛認(rèn)為是一種診斷性生物標(biāo)志物，可用于檢測(cè)早期的人類(lèi)肝細(xì)胞癌。2016年，Ma等[20]基于金納米探針，檢測(cè)AFP濃度。首先在微孔板上固定AFP抗體和AFP抗原以及過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的AFP抗體形成三明治型的免疫復(fù)合物，然后過(guò)氧化氫酶作為催化劑催化H2O2分解為H2O和O2，最后，通過(guò)Fe2+離子作為催化劑使H2O2歧化生成更活潑的自由基(·OH)。·OH與金納米棒(Gold Nanorods, Au NRs)進(jìn)行定量反應(yīng)，·OH可作為氧化劑將Au(0)氧化為Au(III)，溶液顏色的變化覆蓋了從400～ 760 nm的可見(jiàn)光范圍，可以很容易地用肉眼分辨出來(lái)。溶液的最終顏色與靶蛋白的濃度密切相關(guān)。這種方法的檢測(cè)范圍為0～120 ng/mL，LOD為5.0 ng/mL。2017年，Ma等[21]首次將貴金屬納米顆粒的散射光用于同時(shí)檢測(cè)雙重腫瘤生物標(biāo)志物，在三明治免疫分析的基礎(chǔ)上，用兩種雙散射光色的納米探針同時(shí)檢測(cè)甲胎蛋白和癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)。該方法檢測(cè)甲胎蛋白和癌胚抗原具有靈敏度高，選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但是線(xiàn)性范圍較窄。2020年Jiang等[22]開(kāi)發(fā)了一種基于Au@Ag@SiO2的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定系統(tǒng)，通過(guò)雙輪信號(hào)放大策略對(duì)前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)進(jìn)行比色/聚合酶鏈反應(yīng)/熒光檢測(cè)。Cheng等[23]報(bào)道了一種基于兩種無(wú)酶等溫核酸擴(kuò)增方法：雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridization chain reaction, HCR)和催化發(fā)夾組裝(catalyzed hairpin assembly, CHA)的DNA等離子體分析，該方法可通過(guò)肉眼檢測(cè)到超低濃度的PSA。

圖3 NEQ-ELISA檢測(cè)人甲胎蛋白(AFP)的示意圖(a)[20]；在DFM下同時(shí)測(cè)定AFP和CEA的示意圖(b)[21]

外泌體是由活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的納米級(jí)膜囊泡，廣泛存在于各種體液中。因?yàn)橥饷隗w攜帶的多種蛋白質(zhì)反映了親代細(xì)胞的起源，成了癌癥診斷的新興生物標(biāo)志物。2017年，Jiang等[24]報(bào)道了一種基于適體和Au NPs的簡(jiǎn)單比色方法來(lái)檢測(cè)外泌體上的蛋白質(zhì)。2020年，Zhang等開(kāi)發(fā)了一種靈敏且易于操作的基于金納米雙錐(Au nanobipyramids, Au NBPs)的等離子體比色策略。這種等離子體比色法靈敏度高、顏色變化豐富。這種方法由兩部分組成。在第一部分，外泌體引發(fā)競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，在此過(guò)程中，通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)占位鏈產(chǎn)生大量堿性磷酸酶(ALPs)，有效地簡(jiǎn)化了過(guò)程并放大了信號(hào)。在第二部分中Au NBP@MnO2納米片的刻蝕引起Au NBP@MnO2納米片的形態(tài)變化導(dǎo)致金納米粒子的LSPR帶藍(lán)移。因此，可以通過(guò)這種方法簡(jiǎn)單而靈敏地定量外泌體，此外，此方法還可以通過(guò)改變捕獲序列擴(kuò)展到檢測(cè)其他生物分子[25]。

圖4 通過(guò)Au NBP@MnO2NSs的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)和蝕刻進(jìn)行外泌體比色檢測(cè)的原理圖[25]

2.2 生物毒素的檢測(cè)

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是由多種生長(zhǎng)在農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生，它穩(wěn)定性強(qiáng)，難以降解，這種毒素會(huì)引起腎臟損傷。Soh等[26]在Au NPs表面修飾OTA的適體，當(dāng)有OTA存在時(shí)，OTA會(huì)與適體特異性結(jié)合，適體遠(yuǎn)離Au NPs，向體系中加入羥胺(NH2OH)會(huì)將HAuCl4還原成金單質(zhì)在原始的金種上均勻地生長(zhǎng)，此時(shí)觀(guān)察到溶液顏色為紅色;若體系中沒(méi)有OTA存在時(shí)，有適體包裹的金納米顆粒不均勻生長(zhǎng)，溶液的顏色為藍(lán)色。通過(guò)肉眼便能實(shí)現(xiàn)OTA的可視化分析檢測(cè)，檢出限為1 nmol/L。

圖5 可視化檢測(cè)OTA的示意圖[26]

微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是最廣泛存在的藍(lán)藻毒素，具有多種毒性作用，可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)或生殖系統(tǒng)的損傷。2018年，Wei提出一種基于CdS/ZnO空心納米棒陣列的光電流變化和Au NBPs@Ag表面等離子體共振峰的藍(lán)移，構(gòu)建了一種雙模分裂型免疫傳感器來(lái)檢測(cè)微囊藻毒素-LR(MC-LR)。這種方法檢測(cè)的線(xiàn)性范圍為0.05～5 μg/L，對(duì)于PEC檢測(cè)，檢測(cè)下限為0.03 ng/L，而比色檢測(cè)的檢測(cè)下限為0.04 ng/L。該方法具有雙模態(tài)信號(hào)讀出的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了更靈敏、可靠的分析[27]。

圖6 雙模分裂型免疫傳感器來(lái)檢測(cè)微囊藻毒素-LR的示意圖[27]

2.3 核酸的檢測(cè)

MicroRNAs (miRNAs)是一種長(zhǎng)度為19～23個(gè)核苷酸的短非編碼分子，在基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物學(xué)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。然而，由于miRNA在血漿或血清中的序列短、序列相似度高、豐度極低(人血清中<1.0 pM)，因此miRNA的測(cè)定具有挑戰(zhàn)性。由于金納米粒子表面易于被修飾，在金納米粒子與核酸分子結(jié)合后其顏色會(huì)發(fā)生明顯的變化，我們可以利用這一性質(zhì)對(duì)核酸分子進(jìn)行檢測(cè)。2017年，Gu等[28]開(kāi)發(fā)了一種基于催化發(fā)夾自組裝 (cascades of catalyzed hairpin assembly, CHA) 和雜交鏈反應(yīng) (hybridization chain reaction, HCR)擴(kuò)增技術(shù)和Au@Ag納米探針蝕刻的高靈敏度miRNA-141檢測(cè)方法。這種方法對(duì)miRNA-141具有超高的敏感性，動(dòng)態(tài)范圍為5.0×10-17～1.0×10-11M。2019年，Zhao等[29]提出了一種基于等離子體Au@Ag “nanosnowman”形成的對(duì)miRNA高度敏感和選擇性檢測(cè)的新方法。由miRNA-21觸發(fā)的雙金屬納米粒子具有不對(duì)稱(chēng)的Au@Ag頭-體結(jié)構(gòu)，局域表面等離子體共振(LSPR)散射波長(zhǎng)發(fā)生明顯的紅移，顏色由綠色變?yōu)榧t色。結(jié)合HCR擴(kuò)增策略，該測(cè)定方法對(duì)1 fM～100 pM的miRNA-21具有良好的選擇性，在暗場(chǎng)顯微鏡下具有極高的靈敏度，檢測(cè)限為0.60 fM。Cai等[30]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單且低成本的比色分析方法，使用與RNA結(jié)合的寡核苷酸作為傳感探針來(lái)定量檢測(cè)miRNA-148a的濃度。寡核苷酸與Au NPs通過(guò)Au-S鍵結(jié)合，通過(guò)結(jié)合的球核酸探針和目標(biāo)RNA之間的夾心雜交反應(yīng)控制Au NPs分布狀態(tài)(分散/聚集)。

圖7 基于CHA-HCR擴(kuò)增技術(shù)和Au@Ag

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，利用金納米結(jié)構(gòu)獨(dú)特的光學(xué)特性，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列基于金納米結(jié)構(gòu)為光學(xué)探針的化學(xué)和生物傳感器。這些傳感器在檢測(cè)重金屬離子、食品有毒物質(zhì)、蛋白質(zhì)、生物毒素、核酸以及生物小分子方面得到了廣泛的應(yīng)用，具有高靈敏度和高選擇性，可以簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)目標(biāo)物(見(jiàn)表1)。但是將這類(lèi)方法用于實(shí)際檢測(cè)中，還需要做出更多的努力：(1)在合成及納米結(jié)構(gòu)方面，合適的形貌和尺寸直接影響后續(xù)樣品中目標(biāo)靶物的準(zhǔn)確定量分析。(2)現(xiàn)有的基于金納米結(jié)構(gòu)的光學(xué)分析方法靈敏度相對(duì)較低，以后的工作可以借助循環(huán)信號(hào)放大的策略進(jìn)一步提高對(duì)目標(biāo)物的分析靈敏度。(3)在生物檢測(cè)方面，含有生物巰基化合物容易通過(guò)Au-S鍵與金納米結(jié)構(gòu)結(jié)合從而干擾生物分子分析的準(zhǔn)確度，從而造成檢測(cè)過(guò)程中“假陽(yáng)”或“假陰”信號(hào)，帶來(lái)不必要的麻煩，因此，開(kāi)發(fā)捕獲探針與金納米結(jié)構(gòu)更多的連接方式也是非常有必要的，如近些年來(lái)，山東師范大學(xué)唐波老師課題組開(kāi)發(fā)的Au-Se鍵的結(jié)構(gòu)方式，就有利于排除生物巰基化合物在生物成像中的干擾，因?yàn)锳u-Se鍵的結(jié)合方式比Au-S鍵更穩(wěn)定，從而提高了金納米結(jié)構(gòu)在生化分析中的抗干擾能力[34]?；谏鲜鰡?wèn)題，研究者可以繼續(xù)探索新的策略和方法來(lái)優(yōu)化現(xiàn)有的合成方法以及金納米結(jié)構(gòu)的功能化方法以提高金納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在金納米結(jié)構(gòu)表面修飾特定配體如抗體、核酸和肽等，來(lái)提高對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性等。

表1 金納米結(jié)構(gòu)在化學(xué)和生物傳感中的應(yīng)用