何藝博，鄧潔初，閆禹竹，程為平，王 奇，劉 玥

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036;3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇是因感染、腦血管病等多種原因引發(fā)的腦神經元異常放電，臨床以短暫性、發(fā)作性和重復性等中樞神經功能缺損為特征的慢性腦部疾病[1]。據調查，在我國大部分癲癇患者屬于活動性癲癇，且總體人數可達900萬以上[2-3]。雖然現代醫(yī)學可通過病史、癥狀、腦電圖和神經影像學檢查等手段對癲癇作出較明確的診斷，但是在臨床抗癲癇治療中，毒副作用多、單一用藥易耐藥等矛盾仍十分突出。本實驗通過研究電針透穴“太陽”“百會”對戊四氮(PTZ)致癇大鼠一般狀態(tài)、行為學改變以及海馬組織pCREB、NSE水平表達的影響，來探索頭部電針透穴治療癲癇的機制，為針刺治療癲癇提供合理可靠的依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康Wistar雄性大鼠32只，體質量(220±20)g，合格證號：SCXK(吉)2013-0058，長春高新醫(yī)學動物實驗研究中心提供。適應性喂養(yǎng)1周后(保持室溫20～25℃，相對濕度50%～60%，無噪音，干凈衛(wèi)生具有通風設備及空氣過濾設備的飼養(yǎng)環(huán)境)，將大鼠編號、稱重，采用隨機數字表在32只大鼠中取出8只作為空白組，剩余的24只大鼠進行PTZ造模后隨機分為模型組、西藥組及電針透穴組，每組各8只。

1.2 主要儀器與試劑

G6805-Ⅱ型電針(青島鑫升醫(yī)療器械);0.18 mm×13 mm毫針(華佗牌)；戊四氮溶液(美國Sigma公司)；恒溫低溫冰箱(BCD-208KS型，中國青島海爾公司)；治療儀切片機(德國菜卡2135型)；高溫干燥箱(FD53，Binder，德國)。

1.3 模型制作

PTZ點燃模型的制備過程：空白組除外，其余3組造模，以亞驚厥量戊四氮(32 mg/kg)給予大鼠腹腔注射，1次/d，造模制備周期28 d，停藥1周后，再以相同藥物劑量進行末次點燃。按照Smialowki法6級評定，連續(xù)2次5級以上或者連續(xù)5次2級以上驚厥者達到點燃標準[4-5]。將等劑量的生理鹽水腹腔注射正常組、模型組大鼠。在造模過程中，如大鼠持續(xù)性大發(fā)作不止時，給予10%的水合氯醛(5 mg/kg)搶救。根據點燃大鼠Smialowki法分級標準[5]：0級：沒有行為上的發(fā)作；1級：節(jié)律性點頭或頭部抽搐；2級：陣攣性咀嚼；3級：頭部抽搐加前肢陣攣性抽搐；4級：袋鼠姿勢(上身直立)；5級：跌倒；6級：強直性驚厥。

1.4 干預方法

1.4.1 空白組 正常喂養(yǎng)4周，無特殊處置。模型組給予等劑量的生理鹽水腹腔注射，共4周。

1.4.2 西藥組 胃飼苯巴比妥60(mg·kg)/d(貴州光正制藥有限責任公司生產，國藥準字H52020436)，共4周。

1.4.3 電針組 給予頭部電針透穴(太陽透百會)，治療所選腧穴依據參考《實驗針灸學》[6]及華興邦等[7]“大鼠穴位圖譜的研制”，選取百會、太陽穴(雙側)，局部常規(guī)消毒，用0.18 mm×13 mm毫針，沿頭皮太陽透刺百會，刺畢接G6805-Ⅱ型電針治療儀,太陽正極，百會負極，使用連續(xù)波，頻率100 Hz，強度(約1 mA),以大鼠能耐受、不煩躁、嘶叫為度，留針20 min，1次/d，共治療4周。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般狀態(tài) 觀察各組大鼠體毛、攝食情況、精神狀態(tài)以及體質量等情況。

1.5.2 行為學 觀察大鼠癇性發(fā)作潛伏期及發(fā)作等級，癲癇大鼠發(fā)作潛伏期是指兩次發(fā)作間隔時間(單位以秒計算)，發(fā)作等級參照Smialowki分級法。曠場試驗過程：將底部規(guī)格為100 cm×100 cm的木箱中均勻分割出25個方格(20 cm×20 cm)，上方敞開，木箱高度可容實驗大鼠越格，中心9個方格定義為中心區(qū)。觀察指標：①站立數：指大鼠后肢著地，前肢抬起1 cm以上；②理毛次數：指大鼠啃食梳理自己或同伴毛發(fā)的行為；③進入中心區(qū)域次數：指大鼠達到9個中心區(qū)。適應性干預2～3次后正式記錄各組大鼠在60 s內以上行為的次數，每次觀察中間休息10 min，休息時將大鼠移除木箱，共觀察兩次。

1.5.3 大鼠海馬組織中NSE及pCREB的表達 待末次點燃測試后1 h，將大鼠按組別順序處死并取材。一側大腦半球使用4%多聚甲醛溶液固定，再進行石蠟包埋切片；另一側大腦半球，剝離完整海馬冷藏待用。免疫組化法染色觀察NSE、pCREB陽性細胞數。Western-blot法提取細胞核蛋白后，測定pCREB蛋白濃度。免疫組化采用Motic Med6.0病理圖像分析系統(tǒng)，每組每張片隨機觀察并計數3個不重復視野，400倍視野下，利用圖像分析系統(tǒng)，調節(jié)灰度，目測并區(qū)分所選視野內陽性信號的面積，計算陽性細胞的總數，取平均值，每組均分析6例。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般情況

空白組大鼠反應靈敏，體毛有光，飲食二便均正常。模型組與空白組比較，大鼠神經狀態(tài)差，反應遲鈍或易激惹，毛發(fā)變暗變黃、體質量緩增甚至減輕。與模型組比較，電針透穴組大鼠精神狀態(tài)好轉，反應靈活，毛發(fā)漸潤，攝食、二便逐漸恢復，癇性發(fā)作次數以及單次發(fā)作持續(xù)時間均減少。與空白組比較，模型組、電針透穴組大鼠在治療前體質量均明顯減少;電針透穴治療后，與模型組比較，電針透穴組大鼠的體質量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；電針透穴組治療前后比較，大鼠體質量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠治療前后體質量變化情況

2.2 各組大鼠行為學觀察

2.2.1 各組大鼠癇性發(fā)作潛伏期 與模型組比較，經西藥組和電針透穴組治療后，大鼠癇性發(fā)作的潛伏期增長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；電針透穴組，組內治療前后比較，潛伏期增長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠治療前后發(fā)作潛伏期

2.2.2 各組大鼠癇性發(fā)作的驚厥等級 PTZ注射后除空白組外，其余組大鼠逐漸有驚厥行為的表現，且驚厥程度隨點燃周數的增加不斷提高，以模型組變化最為顯著。至末次點燃時，模型組大鼠驚厥級別最高可達6級。就動物驚厥級別而言，西藥組、電針透穴組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，西藥組、電針透穴組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，空白組表現正常，無自發(fā)驚厥行為。見表3。

表3 各組大鼠治療前后Smialowki發(fā)作級別

2.2.3 各組大鼠曠場試驗行為學比較 與空白組比較，模型組大鼠站立次數、進入中心區(qū)域探索次數減少，而理毛等焦慮行為增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與空白組比較，電針透穴組大鼠站立次數減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，理毛次數增加，進入中心區(qū)域次數減少，無顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較，電針透穴組大鼠站立及進入中心區(qū)次數有增加趨勢，理毛等焦慮行為有減少趨勢。見表4。

表4 各組大鼠曠場試驗行為學比較

2.3 各組大鼠海馬區(qū)pCREB及NSE表達情況

2.3.1 各組大鼠海馬內pCREB表達情況 pCREB陽性表達在胞質中，呈黃色或棕黃色，神經元、膠質細胞中均有表達，以神經元細胞質中表達最為明顯，見圖1。與空白組比較，模型組海馬組織中pCREB陽性細胞數明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、電針透穴組海馬中pCREB陽性細胞數明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；西藥組、電針透穴組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組大鼠海馬區(qū)pCREB陽性細胞數以及pCREB細胞核蛋白濃度詳見表5、圖2。

表5 pCREB陽性細胞數及細胞核蛋白濃度表達

圖1 免疫組化檢測大鼠海馬區(qū)pCREB的表達情況

圖2 Western-blot檢測大鼠海馬區(qū)pCREB的表達情況

2.3.2 各組大鼠海馬內NSE表達情況 NSE陽性表達在胞質中，呈黃色或棕黃色,神經元表達居多。與空白組相比，模型組大鼠NSE陽性細胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，西藥組、電針透穴組海馬中NSE陽性細胞數明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 免疫組化檢測大鼠海馬區(qū)NSE的表達情況

3 討論

癲癇是常見神經內科疾病，其致病機制多樣復雜，目前臨床治療手段仍以西藥控制癇性發(fā)作為主，癲癇患者不僅表現為記憶力、學習力和生活能力差，部分患者西藥仍難以控制其癇性發(fā)作，稱之為難治性癲癇，給患者帶來極大的心理壓力與生活負擔。本病中醫(yī)屬“癇證”，古代醫(yī)家早已發(fā)現本病具有易反復、纏綿難愈特點，《素問·長刺節(jié)論》云：“病初發(fā)，歲一發(fā)，不治月一發(fā)”。大量臨床試驗表明，電針或頭穴針刺可減輕患者癲癇發(fā)作程度，延長發(fā)作間隔時間，但將二者結合應用的相關報道尚不多，其相關機制研究亦不明確。本實驗采用PTZ注射，建立大鼠慢性點燃的癲癇模型，模擬人體癲癇發(fā)病過程，研究癲癇的易損傷區(qū)海馬組織NSE、pCREB蛋白的表達，探討慢性點燃癲癇形成過程中的神經損傷機制，為該方法臨床應用提供理論基礎。

“頭者，諸陽之會也。”頭部的經絡聯周身臟腑，通調全身氣機。百會穴屬督脈位于巔頂，“頂中央旋毛中”,達陰陽脈絡，聚諸陽之氣，集全身氣血[8]；太陽穴屬經外奇穴，可提神醒腦通絡，百會太陽相透刺，在頭部貫穿額、頂和顳三區(qū)，且跨督脈、足太陽膀胱經和足少陽膽經[9]，跨越多個穴區(qū)，可以起到以一帶多，縱貫全身，并入絡腦發(fā)揮各區(qū)協同之用。透穴刺法具有針感強、療效好的特點，使治療不局限于單穴作用位點，擴大了療效范圍。本實驗在電針基礎上配以頭穴透刺法，頭針通調腦絡、協調陰陽，而透刺則具“接氣通經”之功，二者配合，可顯著提高療效。從現代醫(yī)學理論而言，頭穴透刺針法以大腦皮層反應區(qū)為理論基礎，具有調控突觸間神經遞質傳遞、降低突觸后膜興奮性和減少突觸前膜Glu釋放等作用[10]，有研究[11]顯示頭穴透刺頂顳前斜線、頂中線后，使大鼠海馬齒狀回、CA3區(qū)Syn及Glu表達水平降低，減少谷氨酸等興奮性氨基酸表達，從而降低其對大腦神經元的損害。韓桂蓮[12]在實驗中發(fā)現透穴埋線療法可有效延長癲癇患者發(fā)作間期，改善頭暈嗜睡等藥物不良反應，隨訪提示透穴埋線組較普通治療組遠期療效更佳，這與本實驗觀察到的頭穴透刺組大鼠行為學變化具有一致性。在穴位電刺激理論研究方面，王津存等認為電針刺激致癇大鼠“百會”穴使其腦電及行為學發(fā)生改變，是由于神經沖動傳入三叉神經感覺核后，經網狀結構投射到腦內多個區(qū)域，產生特定的抑癇信號，該抑癇信號糾正或清除了已形成的異常放電[13]，從而達到治療癲癇的效果。

神經元特異性烯醇化酶(NSE)，特異性定位于神經元及神經內分泌細胞中，當SE發(fā)作時，大量自由基被釋放，血腦屏障(BBB)受到破壞，腦脊液及血清中可檢測出NSE[14]，而NSE具有良好的神經元特異性，在體液中穩(wěn)定性強，因此被廣泛認為是評價神經元損傷的標志物，可早期較靈敏反應神經元受損程度[14-15]。許多關于抗癇西藥(如卡馬西平、奧卡西平)的機制研究均圍繞NSE展開。本實驗發(fā)現，與空白組比較，慢性癲癇點燃的模型組大鼠海馬內NSE表達明顯增加，在鋰-匹羅卡品誘導的SE大鼠也觀察到類似的結果，這可能與血腦屏障(BBB)通透性增強有關[16]。本實驗中電針透穴組治療后對比模型組，NSE表達明顯減低，但其降低幅度尚不及西藥組，二者相比差異無統(tǒng)計學意義，說明電針透穴可能與苯巴比妥抗癇的機制均具有減少神經元損傷，改善神經細胞營養(yǎng)狀態(tài)的作用，這與觀察熱性驚厥患兒血清NSE、S-100β表達水平明顯低于對照組且臨床療效高于對照組的實驗結論一致[17-18]。環(huán)腺苷酸反應元件結合蛋白(cREB)是一種核蛋白，cREB磷酸化影響著許多信號通路的轉導，極大影響神經元的生長增殖、周期調控和突觸可塑性等。近年來的研究表明磷酸化信號通路在癲癇發(fā)病機制中亦發(fā)揮重要作用[19]。應激損傷后，機體可通過Ca2+以及激活cAMP依賴的蛋白激酶、絲裂源活化的蛋白激酶等，使cREB的Scrl33殘基磷酸化成為pCERB[20]。磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(pCREB)與CREB結合蛋白(CBP)形成復合物，與靶基因CRE結合，參與細胞調控轉錄。癲癇發(fā)作時CREB表達增加，而CREB活性受抑制可改善癇性發(fā)作狀態(tài)，延長發(fā)作間隔時間，這種情況在大鼠海馬組織中表達尤為突出。有研究檢測難治性顳葉癲癇患者大腦皮層組織發(fā)現，患者顳葉新皮層pCREB表達與對照組比較明顯增強，提示pCREB可能在癲癇患者腦內存在特異性分布的情況。本實驗采用慢性點燃癲癇大鼠模型，電針透穴組大鼠海馬組織內pCREB表達明顯下降，這與Zhu等發(fā)現抑制CREB活性可延長慢性癲癇發(fā)作間隔時間、減少實驗鼠癲癇持續(xù)發(fā)作時間具有一致性[21]。此外，研究發(fā)現氯化鋰-匹羅卡品誘導的SE大鼠在發(fā)作3 d、1周、2周及8周等時間點，海馬組織中CREB及pCREB與對照組相比明顯增加，這一結論同樣適用顳葉癲癇患者腦皮質內[22]。以上動物實驗及臨床研究結果均提示，在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中CREB轉錄因子磷酸化信號通路極可能扮演重要角色。

綜上所述，頭穴透刺太陽、百會可有效改善癲癇大鼠一般狀態(tài)，延長癲癇發(fā)作時間，減輕癇性發(fā)作程度，一定程度上改善癲癇大鼠認知障礙及焦慮行為，具有抑制癲癇大鼠海馬組織中NSE、pCREB高表達的作用，其抗癇機制可能通過調控CREB磷酸化通路、減輕神經元損傷實現。本實驗為電針及頭穴透刺治療癲癇提供新思路，考慮針刺治療量效的復雜性，電針透穴治療癲癇具體的機制有待進一步補充完善。