曹洪濤，于學(xué)平，戴曉紅，滕 偉，匡炳霖，于薇薇，李明月，鄒 偉△

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)是卒中患者預(yù)后最差的疾病之一，全球范圍內(nèi)發(fā)病率約為24.6/100 000，且發(fā)病早期死亡率極高，幸存者多遺留有運(yùn)動(dòng)、感覺、語言等不同類別、不同程度的功能障礙，支持性護(hù)理是目前治療本病的主要方法[1-3]。ICH發(fā)生后的最初幾個(gè)小時(shí)由于血腫或水腫壓迫造成原發(fā)性腦損傷，引起占位效應(yīng)和顱內(nèi)壓升高，從而導(dǎo)致腦疝和死亡。繼發(fā)性腦損傷是由小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的，小膠質(zhì)細(xì)胞會驅(qū)動(dòng)促炎、氧化和細(xì)胞毒性級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和功能障礙[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為關(guān)鍵的先天免疫細(xì)胞，在應(yīng)對急性腦損傷時(shí)，激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞可以動(dòng)態(tài)地和暫時(shí)地改變它們的表型，發(fā)展成經(jīng)典激活(M1型，產(chǎn)生促炎介質(zhì))或替代激活(M2型，產(chǎn)生抗炎介質(zhì))表型，被認(rèn)為是對ICH等各種急性腦損傷做出反應(yīng)的第一個(gè)非神經(jīng)元細(xì)胞[4-6]。最初發(fā)生腦出血等急性腦損傷時(shí)，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在損傷區(qū)域占據(jù)主導(dǎo)地位，并產(chǎn)生大量IL-1β等促炎因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)加劇腦損傷[7]。

筆者先前研究表明，針刺百會透曲鬢穴可以抑制Mincle、Syk、CARD9的免疫反應(yīng)和蛋白表達(dá)，降低腦組織中促炎因子IL-1β的含量，減輕腦出血后炎性損傷，改善腦出血后的神經(jīng)功能障礙[8]。但從針刺能否抑制激活后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞方面探討針刺對腦出血腦保護(hù)作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(CD86、iNOS)及炎癥因子(IL-1β)作為觀察指標(biāo)，觀察針刺對腦出血大鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥的影響，探討本法治療腦出血的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取的147只體質(zhì)量為(280±20)g、年齡為7～8周的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,均購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)[證書編號：SCXK(黑龍江)2017-004]，所有大鼠可自由獲得潔凈水源和標(biāo)準(zhǔn)食物，并在溫度(20±2)℃和濕度(50±5)%可控的動(dòng)物房中進(jìn)行12 h光照/黑暗周期飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2020-09-24-01)。并依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 儀器 立體定位儀(ST-5ND-C，中國成都儀器廠)；臺式牙鉆機(jī)(307-6型，中國上海齒科醫(yī)械廠)；電泳儀(DYY-7C，北京六一儀器廠)；石蠟包埋機(jī)(JB-L5，武漢俊杰電子有限公司)。

1.2.2 試劑 CD86多克隆抗體(bs-1035R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國)；iNOS多克隆抗體[ab49999，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，中國]；白介素1β(IL-1β) ELISA檢測試劑盒(WLE03，沈陽萬類生物科技有限公司，中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組

隨機(jī)將147只大鼠分為假手術(shù)組、模型組及針刺組，每組49只，將所有組分為4個(gè)亞組，6 h組(n=10)、1 d組(n=10)、3 d組(n=19)和7 d組(n=10)，分別在治療后6 h、1 d、3 d和7 d時(shí)，各亞組均取10只大鼠評定各組大鼠改良的神經(jīng)功能缺損評分，然后處死大鼠，取腦組織樣本進(jìn)行HE染色，評價(jià)針刺對腦組織病理損傷及神經(jīng)功能的影響；3 d時(shí)各組大鼠相關(guān)治療結(jié)束后，空白組、模型組及針刺組均取9只大鼠腦組織樣本，進(jìn)行Western blot檢測(每組3只)、免疫熒光染色(每組3只)及ELISA試劑盒檢測(每組3只)，評價(jià)針刺對M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的影響。

1.4 造模方法

將小鼠通過腹膜內(nèi)注射2 %戊巴比妥鈉(40 mg / kg)麻醉后，固定在立體定位儀中。用牙鉆(前囟點(diǎn)后0.2 mm，右側(cè)3.5 mm)鉆一個(gè)毛刺孔(直徑1 mm)，直到到達(dá)腦膜。從大鼠尾靜脈采集50 μL自體血，然后將微量注射器在立體定位儀上固定，將針頭沿鉆孔進(jìn)針約6 mm，以20 μL/min速度注射到尾狀核，5 min后緩慢取出微量注射器。然后用牙科水泥封住穿刺口，縫合皮膚，最后對傷口進(jìn)行包扎和消毒。假手術(shù)組進(jìn)行腦出血模型制備的各項(xiàng)手術(shù)操作，但不注血。造模完成后，待大鼠清醒，依據(jù) Berderson 評分法[9]對造模后大鼠進(jìn)行評分。評分1～3分的大鼠被作為腦出血成功模型，納入實(shí)驗(yàn)。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 假手術(shù)組 進(jìn)行腦出血模型制備的各項(xiàng)手術(shù)操作，但不注血。

1.5.2 模型組 僅進(jìn)行腦出血模型制作，不做任何干預(yù)治療。

1.5.3 針刺組 造模成功后12 h，對大鼠進(jìn)行針刺治療。針刺部位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]選取大鼠百會穴(頂骨正中)及大鼠曲鬢穴(患側(cè))(右眶外緣與右外耳門連線的后2/3)。操作方法：選用規(guī)格為0.30 mm×25 mm的一次性使用針灸針(華佗；蘇州)從百會穴透刺至患側(cè)曲鬢穴，然后選用經(jīng)過至少24 h訓(xùn)練的針灸醫(yī)師將針以(190±10)r/min 的速度進(jìn)行左右交替旋轉(zhuǎn)，持續(xù)刺激5 min后休息5 min，連續(xù)治療3次。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)評價(jià) 選用改良的神經(jīng)功能缺損評分[11](modified Neurological Severity Score，mNSS)評價(jià)各組大鼠神經(jīng)功能。

1.6.2 HE染色 灌注后，切取大鼠出血部位中心位置前后2 mm的腦組織，包埋，切取4 μm厚的組織切片，HE染色，高倍鏡觀察病理損傷。

1.6.3 Westernblot檢測腦組織CD86、iNOS蛋白表達(dá) 取凍存于-80 ℃冰箱的各組腦組織，將腦組織勻漿離心后分離上清取上清液，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度。20 μL處理后的蛋白樣品加入電泳槽中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂奶粉封閉，相應(yīng)條帶分別加入一抗CD86(1∶1 000)、iNOS(1∶500)，4 ℃孵育過夜。漂洗好PVDF膜后加入二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育45 min。洗滌后緩慢搖動(dòng)洗滌5 min×6次，濾紙吸干水分后，靜置反應(yīng)5 min，最后將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6.4 免疫熒光 腦組織取出后，放入10 %的多聚甲醛并置入4 ℃冰箱中固定24 h后，包埋，切片，脫蠟，水化后，PBS洗5 min×3次。切片放入含有檸檬酸PH6.0修復(fù)液的修復(fù)盒，中火5 min煮沸，?；鸨? min，低火10 min。冷卻后PBS洗5 min×3次，加入一抗CD86(1∶200)、iNOS(1∶2 000)，4 ℃避光過夜。室溫放置復(fù)溫30 min，PBS洗5 min 3次，滴加熒光二抗，二者均用PBS 1∶200稀釋，室溫避光孵育60 min。PBS洗5 min 3次，滴加DAPI，復(fù)染核8 min。PBS洗5 min 3次，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。

1.6.5 ELISA檢測 取大鼠腦組織勻漿上清進(jìn)行ELISA檢測，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠mNSS評分比較

造模前所有大鼠mNSS評分均為0分。假手術(shù)組術(shù)后均未見明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。模型組與針刺組大鼠于造模后6 h時(shí)均表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，1 d、3 d及7 d時(shí)均有神經(jīng)缺損癥狀；針刺組與模型組比較，各時(shí)間大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.2 3組大鼠HE染色結(jié)果

6 h、1 d、3 d和7 d時(shí)，假手術(shù)組大鼠基底節(jié)區(qū)可見腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，少量炎性細(xì)胞浸潤，無出血點(diǎn)。模型組大鼠在造模6 h后可見大量血細(xì)胞溢出，神經(jīng)纖維腫脹，神經(jīng)元數(shù)量減少;1 d時(shí)大量血細(xì)胞溢出，炎性細(xì)胞增多；術(shù)后3 d時(shí)：腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤，大量血細(xì)胞溢出；術(shù)后7 d時(shí)，出血范圍及炎性細(xì)胞減少。與模型組相比，針刺組各時(shí)間點(diǎn)出血灶范圍縮小，炎性細(xì)胞相對降低，腦組織病理結(jié)構(gòu)破壞程度降低。見圖1。

表1 3組大鼠mNSS評分比較

圖1 3組大鼠HE染色結(jié)果

2.3 3 d時(shí)3組大鼠腦組織CD86蛋白比較

假手術(shù)組可見CD86蛋白弱陽性表達(dá)；模型組CD86蛋白表達(dá)明顯增高。與模型組比較，針刺組CD86蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 3 d時(shí)3組大鼠腦組織CD86蛋白比較

表2 3 d時(shí)3組大鼠腦組織CD86蛋白比較

2.4 3 d時(shí)3組大鼠腦組織iNOS蛋白比較

假手術(shù)組可見iNOS蛋白少量表達(dá)；模型組iNOS蛋白表達(dá)明顯增高。與模型組比較，針刺組iNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 3 d時(shí)3組大鼠腦組織iNOS蛋白比較

表3 3 d時(shí)3組大鼠腦組織iNOS蛋白比較

2.5 3 d時(shí)3組大鼠CD86、iNOS免疫熒光雙染結(jié)果

免疫熒光雙染示3組大鼠均有CD86、iNOS共表達(dá)陽性細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，針刺組、模型組CD86、iNOS共表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多；與模型組比較，針刺組CD86、iNOS共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。見圖4。

2.6 3 d時(shí)3組大鼠IL-1β ELISA檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦組織IL-1β表達(dá)較低；與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組腦組織IL-1β表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組腦組織IL-1β表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見表4。

圖4 3 d時(shí)3組大鼠CD86、iNOS免疫熒光雙染結(jié)果

表4 3 d時(shí)3組大鼠IL-1β ELISA檢測結(jié)果比較

3 討論

腦出血在中醫(yī)學(xué)屬“中風(fēng)病”范疇，針刺治療本病療效確切，其中頭針治療本病效果更為顯著[12]。百會位居巔頂，屬督脈，各經(jīng)脈氣會集之所，通經(jīng)舒絡(luò)。曲鬢穴為足太陽、足少陽交會穴，其通經(jīng)舒絡(luò)、調(diào)達(dá)氣血，具有振頹療癱的作用。早在古籍《普濟(jì)方》中就有“凡忽中風(fēng)，言語謇澀，半身不遂……穴百會，耳前發(fā)際曲鬢穴”的記載?，F(xiàn)代臨床研究證明，針刺百會透曲鬢穴能夠提高治療腦出血的臨床療效，降低患者神經(jīng)功能缺損程度[13]；動(dòng)物研究證實(shí)針刺百會透曲鬢穴能夠減輕腦出血后炎性損傷，改善腦出血后的神經(jīng)功能障礙[8，12]，說明頭針在抑制炎癥、減輕神經(jīng)功能障礙方面具有重要作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的主要吞噬細(xì)胞，ICH后被腦損傷迅速激活，發(fā)展成經(jīng)典激活(M1型，促炎)或替代激活(M2型，抗炎)表型，在 ICH 中具有雙重作用[14]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可通過吞噬血腫以及細(xì)胞碎片，進(jìn)而維持受損組織穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。但在此過程中，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞也會產(chǎn)生多種有害細(xì)胞因子，如促炎因子(IL-1β)等，增加腦出血后腦損傷[15-16]。雖然在ICH急性期整體 M1和 M2標(biāo)記物水平都增加，但流式細(xì)胞術(shù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)展為M1表型[17-18]，其已被證明會產(chǎn)生促炎因子，且激活后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量與神經(jīng)功能損傷相關(guān)[19]。Wang等[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)，加劇小鼠腦出血后的腦損傷。抑制ICH后激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，有助于減輕炎癥誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷，起到腦保護(hù)作用[4]。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞與炎性反應(yīng)相關(guān)炎性因子具有密切聯(lián)系。炎性反應(yīng)作為ICH重要的病理機(jī)制，多項(xiàng)研究證實(shí)炎癥因子IL-1β與ICH后繼發(fā)性腦損傷關(guān)系密切[21-22]。

本實(shí)驗(yàn)采用mNSS評分法觀察到模型組與針刺組大鼠于造模后6 h時(shí)均表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，1 d、3 d及7 d時(shí)均有神經(jīng)缺損癥狀；針刺組與模型組比較，各時(shí)間大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低，說明針刺可以降低ICH大鼠神經(jīng)功能評分，有效改善神經(jīng)功能缺損癥狀。模型組大鼠在造模6 h后可見大量血細(xì)胞溢出，神經(jīng)纖維腫脹，神經(jīng)元數(shù)量減少;1 d時(shí)大量血細(xì)胞溢出，炎性細(xì)胞增多；術(shù)后3 d時(shí)：腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤，大量血細(xì)胞溢出;術(shù)后7 d時(shí)，出血范圍及炎性細(xì)胞減少。與模型組相比，針刺組各時(shí)間點(diǎn)上述病理情況均有所減輕，表明針刺能夠減輕腦出血大鼠的腦組織炎性損傷。經(jīng)Westernblot檢測可見，模型組CD86、iNOS蛋白表達(dá)明顯增高。與模型組相比，針刺組CD86、iNOS蛋白表達(dá)明顯降低，說明針刺能夠抑制CD86、iNOS蛋白表達(dá)。經(jīng)免疫熒光雙染示3組大鼠均有CD86、iNOS共表達(dá)陽性細(xì)胞；與模型組比較，針刺組CD86、iNOS共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。同時(shí)，ELISA試劑盒檢測IL-1β可見模型組、針刺組腦組織IL-1β表達(dá)明顯升高,與模型組比較針刺組腦組織IL-1β表達(dá)明顯降低，說明針刺能夠有效降低ICH大鼠腦組織炎癥因子IL-1β表達(dá)。

綜上，針刺百會透曲鬢穴可能通過抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，降低炎癥因子IL-1β表達(dá)，減輕ICH后炎癥損傷，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，發(fā)揮腦保護(hù)作用。但針刺如何抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，及是否通過促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，進(jìn)而降低炎癥因子IL-1β表達(dá)，尚需進(jìn)一步論證，以期為臨床治療本病提供新思路。