包少魁，于交遠(yuǎn),2，陳純?nèi)A，金東海，王愛(ài)華

（1. 呼倫貝爾市公安局刑事偵查支隊(duì)，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021001；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100038）

氯胺酮（Ketamine），即2-（2-氯苯基）-2-甲氨基環(huán)己酮，化學(xué)式為C13H16ClNO，是一種苯環(huán)己哌啶衍生麻醉藥物[1]，俗稱(chēng)K粉，為我國(guó)典型毒品之一。濫用氯胺酮會(huì)使人產(chǎn)生分離性幻覺(jué)，長(zhǎng)期濫用會(huì)損害泌尿系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，并引發(fā)記憶缺失、認(rèn)知功能損害和精神病[2]，2003年公安部將其列入毒品范疇。隨著我國(guó)近年來(lái)對(duì)毒品打擊力度的不斷加大，不法分子一直致力于新型毒品的開(kāi)發(fā)，以便獲取經(jīng)濟(jì)利益并逃脫法律制裁，氟胺酮（F-Ketamine）就是其中之一。氟胺酮又名2-（2-氟苯基）-2-甲氨基環(huán)己酮，化學(xué)式為C13H16FNO，其分子結(jié)構(gòu)與氯胺酮的唯一區(qū)別就是使用F原子替代了氯胺酮中的Cl原子，如圖1所示，二者同屬苯環(huán)己哌啶衍生麻醉藥物。王世玉[3]以及Moghimi等[4]均報(bào)道過(guò)成功合成了氟胺酮，且發(fā)現(xiàn)其具有與氯胺酮相似的麻醉活性，即濫用氟胺酮一樣具有毒品效力。

目前，氟胺酮在我國(guó)多個(gè)地區(qū)均有繳獲，呈現(xiàn)出越來(lái)越嚴(yán)峻的流行趨勢(shì)，探索氟胺酮的檢驗(yàn)鑒定方法對(duì)打擊毒品犯罪具有重要實(shí)戰(zhàn)意義。張磊等[5]和莊順等[6]相繼報(bào)道了氟胺酮的氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）檢驗(yàn)方法 ；Krotulski等[7]和 H?gele等[8]分別使用液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（LC-QTOFMS）和高效液相色譜紫外法（HPLC-UV）檢測(cè)出了生物檢材中的多種新型精神活性物質(zhì)，其中包含氟胺酮；Tang等[9]使用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）檢出了尿液中的氟胺酮；謝明清等[10]報(bào)道了全血中氟胺酮的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢驗(yàn)方法；蔡玉剛等[11]也建立了氟胺酮的HPLCMS/MS檢驗(yàn)方法，并研究了氟胺酮在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律。鑒于氯胺酮與氟胺酮的結(jié)構(gòu)極其相似，而且從以往案件總結(jié)發(fā)現(xiàn)，吸毒人員所吸食毒品種類(lèi)往往并不單一，探究同時(shí)對(duì)生物檢材中氯胺酮與氟胺酮進(jìn)行定性定量的方法具有重要意義。為豐富苯環(huán)己哌啶衍生物的檢測(cè)手段，本文就血液中氯胺酮與氟胺酮的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）檢驗(yàn)方法展開(kāi)相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260-6420 LC-MS/MS儀器（美國(guó)Agilent公司），Thermo Biofuge primo離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），TALBOYS 945617渦旋儀（美國(guó)TROEMNER），津騰（尼龍66）0.22 μm濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國(guó)天津阿爾塔科技有限公司，濃度均為1.00 mg/mL），甲醇（中國(guó)上海MACKLIN）、乙腈（美國(guó) J. T. Baker）、甲酸、甲酸銨（美國(guó)Fisher Scientific）均為HPLC級(jí)，乙酸乙酯、硼砂為分析純，實(shí)驗(yàn)用血為取自中心血站的新鮮血液，實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

根據(jù)需要，實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液均使用甲醇對(duì)1.00 mg/mL氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行逐級(jí)稀釋得到，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品的制備

取血液樣品1.00 mL置于15 mL塑料離心管中，加入2.00 mL乙腈沉淀蛋白，振蕩提取10 min，8 000 r/min離心10 min，分離有機(jī)相，用0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，供LC-MS/MS分析。

1.4 LC-MS/MS條件

為與前期研究（LC-MS/MS分析研究毛發(fā)中29種毒品）保持延續(xù)性，實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS條件如下：

色譜柱：Kinetex 1.7 μm Biphenyl 100 ?（LC Column 100 × 2.1 mm）；流動(dòng)相A：0.01%甲酸-1.0 mmol/L甲酸銨水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；進(jìn)樣體積：2 μL；流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions for gradient elution

離子化方式：ESI+；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），目標(biāo)物選擇兩個(gè)母離子/子離子對(duì)作為定性離子對(duì)，具體質(zhì)譜參數(shù)及參考保留時(shí)間見(jiàn)表2。

表2 氯胺酮、氟胺酮的檢測(cè)參數(shù)Table 2 Mass spectral parameters of ketamine and F-ketamine

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)效應(yīng)

毒物分析中最常用的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法是提取加入法，通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積（S1）和空白樣品基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后的色譜峰面積（S2），以比值S2/S1（%）來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。液液萃取和乙腈沉淀蛋白是生物檢材中毒物最為常見(jiàn)的提取方法。本文對(duì)空白血液按液液萃取法（參考GA/T 1530-2018）和乙腈沉淀蛋白法（文中1.3步驟）處理，得到空白樣品提取液，空白樣品提取液中分別添加氯胺酮、氟胺酮以及氯胺酮和氟胺酮混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使其濃度均為10.0 ng/mL，得到兩種提取方式下的基質(zhì)添加樣品，按1.4條件檢驗(yàn)。取10.0 ng/mL氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4條件檢驗(yàn)，并計(jì)算基質(zhì)添加樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積比，計(jì)算結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知，血液采用液液萃取和乙腈沉淀蛋白兩種前處理方法，基質(zhì)效應(yīng)均不顯著，且兩種前處理方法中氯胺酮和氟胺酮相互間無(wú)明顯干擾，但使用液液萃取法提取血液樣品中氯胺酮和氟胺酮的回收率低于乙腈沉淀蛋白法，且乙腈沉淀蛋白法無(wú)需濃縮、復(fù)溶等步驟，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，所需有機(jī)溶劑量少，因此本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)的前處理方法均采用乙腈沉淀蛋白法。

表3 兩種前處理方法基質(zhì)效應(yīng)比較Table 3 Comparison of matrix effect resulted from two pretreatment choices

2.2 專(zhuān)屬性

按照1.3操作步驟，分別對(duì)空白血樣和空白添加血樣（混合添加氯胺酮、氟胺酮濃度為30.0 ng/mL）進(jìn)行提取，使用LC-MS/MS測(cè)試，與氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度為10.0 ng/mL）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示空白添加血樣中氯胺酮、氟胺酮與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間一致，兩特征離子對(duì)相對(duì)豐度比相似（相對(duì)偏差＜10%），空白血樣陰性無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3 線(xiàn)性范圍和檢出限

移取空白血樣1.00 mL共7份，分別添加適量氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使血液中氯胺酮、氟胺酮濃度分別為 1.50、3.00、6.00、15.0、30.0、60.0、150 ng/mL，按照1.3操作步驟，分別進(jìn)行提取，供LCMS/MS分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，計(jì)算峰面積平均值，結(jié)果如表4所示。

表4 氯胺酮、氟胺酮定量離子對(duì)峰面積Table 4 Peak area of quantitative ion pair of ketamine and F-ketamine

以濃度對(duì)定量離子的峰面積進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到氯胺酮、氟胺酮的線(xiàn)性回歸方程分別為：y=60.830x-15.322（R2=0.999 9）、y=96.056x+94.065（R2=0.999 2），在1.50～150 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

于空白血樣中添加一組（n=7）低濃度（1.20 ng/mL）的氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.3操作步驟，分別進(jìn)行提取，供LC-MS/MS分析，根據(jù)定量結(jié)果計(jì)算檢出限（MDL=t（n-1,0.99）×S，其中t（6,0.99）=3.143，S為7次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差），確定氯胺酮、氟胺酮的方法檢出限均為0.30 ng/mL，以3.3倍檢出限作為定量下限，為1.00 ng/mL。

2.4 回收率和精密度

配制濃度分別為1.50、3.00、6.00、15.0、30.0、60.0、150 ng/mL的氯胺酮、氟胺酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供LC-MS/MS分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，計(jì)算峰面積平均值，以濃度對(duì)定量離子的峰面積進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到氯胺酮、氟胺酮的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，方程分別為：y=71.565x-10.846（R2=0.999 5）、y=117.603x-10.914（R2=0.999 6）。

使用空白血樣配制低中高3個(gè)濃度（3.00、15.0、60.0 ng/mL）的氯胺酮、氟胺酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加樣品，每一個(gè)濃度點(diǎn)平行移取6份，按照1.3操作步驟，分別進(jìn)行提取，供LC-MS/MS分析，每一個(gè)濃度點(diǎn)每天測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄氯胺酮、氟胺酮定量離子對(duì)峰面積。使用上述校準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸計(jì)算血樣中氯胺酮、氟胺酮濃度，進(jìn)而計(jì)算回收率、日內(nèi)精密度以及日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 氯胺酮、氟胺酮的回收率和精密度（n=6）Table 5 Recoveries and precisions of ketamine and F-ketamine(n=6)

3 小結(jié)

本文成功探索了一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）同時(shí)分析血液中氯胺酮與氟胺酮的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用該方法測(cè)定血液中的氯胺酮與氟胺酮，基質(zhì)效應(yīng)不顯著，血液中氯胺酮與氟胺酮之間無(wú)相互干擾，專(zhuān)屬性好；血液中氯胺酮與氟胺酮濃度在1.50～150 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，方法檢出限為0.30 ng/mL，定量限為1.00 ng/mL，精密度以及回收率較高。該方法操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)靈敏，重復(fù)性好，適用于血液中氯胺酮與氟胺酮的定性定量分析，為苯環(huán)己哌啶衍生物的管控及相關(guān)案件的檢驗(yàn)鑒定提供技術(shù)支撐。