郭江玲，尚 蕾，李萬水，丁光樹，楊 帆，孫 敬，孫 輝,*，張更謙

（1. 山西醫(yī)科大學，太原 030001；2. 公安部物證鑒定中心，現(xiàn)場物證溯源技術國家工程實驗室，北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術研究中心，法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038）

二代測序技術（second generation sequencing，SGS）也叫下一代測序（next generation sequencing，NGS）或大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS），其特點是通量較大，各個測序反應平行進行，可以實現(xiàn)規(guī)模化測序，能為法醫(yī)學個案研究提供新的可能，故正愈益成為法醫(yī)遺傳學中大有前途的一種方法。

相較于毛細管電泳技術，二代測序的優(yōu)勢在于：

1） 體系可以容納更多種類、更多數(shù)量的基因座。

2） 可得到詳細的序列信息，從而顯著增加基因座的多態(tài)性。

3）擴增片段更短，更適用于法醫(yī)微量或降解檢材[1]。

目前常用的測序平臺有MiSeq FGxTM系統(tǒng)（Illumina，美國）和Ion PGM測序平臺（Thermo Fisher，美國）。MiSeq FGxTM系統(tǒng)是專門為法醫(yī)服務的一個測序平臺，其配套試劑盒Forenseq DNA Signature Prep kit包含27個常染色體STR基因座、24個Y-STR基因座、7個X-STR 基因座、94個身源識別SNP位點、22個表型SNP位點和56個地域祖先來源SNP位點。該試劑盒具有較高的靈敏度、準確度和可重復性[2-4]。

本實驗分別使用CE-STR試劑盒和Forenseq DNA Signature Prep kit試劑盒對41份家系樣本進行檢測分析，旨在評估等位基因序列信息對等位基因數(shù)目的增加情況并比較二代測序與傳統(tǒng)毛細管電泳分型之間的一致性。

1 材料與方法

1.1 樣本DNA提取與定量

六個家系（圖1）共41份血卡樣本，每個血卡各剪取1 cm2試樣，使用96道微量DNA提取工作站（博坤生物，吉林長春）進行DNA提取，得到約30 μL的DNA溶液。用Qubit3.0（Thermo Fisher，美國）定量至濃度在0.2～2 ng/μL之間。

本研究經(jīng)公安部物證鑒定中心科研倫理委員會審查通過，符合要求。樣本提供者均簽署了知情同意書。

1.2 毛細管電泳檢測

使用DNATyperTM21、DNATyperTMY36、DNATyperTMX19試劑盒（均為公安部物證鑒定中心產(chǎn)品）對所有樣本按說明書進行擴增檢測，擴增產(chǎn)物以3730XL型基因分析儀（Thermo Fisher, 美國）電泳檢測，采用GeneMapper ID-X 1.5進行分析。對NGS與CE結果不一致的樣本加做Investigator Argus X-12 QS試劑盒（QIAGEN，德國）驗證。

1.3 NGS文庫構建及測序

將所有樣本DNA稀釋至0.2 ng/μL，按照Forenseq DNA Signature Prep kit試劑盒說明書構建文庫，DNA模板輸入量為1 ng。擴增遺傳標記包括27個常染色體STR、24個Y-STR、7個X-STR和94個iSNP。使用MiSeq FGxTMReagent Kit試劑盒Micro Flow Cell芯片，按說明書在MiSeq FGxTM測序儀上進行測序，原始數(shù)據(jù)以Forenseq UAS（Illumina，美國）在默認分析閾值下處理。對其中不一致樣本使用方明生物信息分析平臺（北京中科方明科技公司）進行二次分析，分析閾值和解釋閾值分別為2%、5%。

1.4 Sanger測序

對家系D中所有男性樣本的DYS392基因座進行Sanger測序（生工生物，上海）；對DXS7132基因座二代測序與CE分型結果不一致的8份樣本以及分型一致的3份樣本（A-2、D-5、D-11）也進行Sanger測序。

2 結果與分析

2.1 測序質量評估

兩次測序的簇密度（cluster density）分別為1 553 K/mm2、1 335 K/mm2（推薦范圍為 400～1 650 K/mm2）；簇通過率（cluster passing filter）分別為86.08%、89.88%（推薦范圍為≥80%）；定向值（phasing）分別為0.144%、0.171%（推薦范圍為≤0.25%）；預定向值（pre-phasing）分別為0.162%、0.063%（推薦范圍為≤0.15%）。其中第一次測序預定向值超出推薦范圍，或因簇密度較高導致，其余參數(shù)均在推薦范圍內，總體測序質量較好。

2.2 等位基因序列多態(tài)性

二代測序能夠獲得序列信息，可以發(fā)現(xiàn)更多的等位基因“亞型”[5]。本次實驗檢測41個樣本，所測58個基因座共有2 378個等位基因的序列分型，其中有26個基因座發(fā)現(xiàn)了等位基因亞型，等位基因數(shù)目增加情況如表1，以D12S391增加最為顯著，由9個增加到18個，對于常染色體STR以及X-STR、Y-STR基因座，等位基因總數(shù)分別由204、45、91增加到了265、51、103，共增加了79個。

表1 41個樣本中STR基因座等位基因數(shù)目增加情況Table 1 Occurrence to increased number of STR alleles among 41 samples

2.3 二代測序與CE結果一致性比較

2.3.1 分型不一致樣本情況及分型

58個STR基因座中有4個基因座（D2S441、D10S1248、D22S1045、DXS10074）無CE結果，對其余基因座進行一致性比較，發(fā)現(xiàn)41個樣本中有9個樣本出現(xiàn)與CE結果不一致的情況，如表2所示。

表2 二代測序與CE結果不一致情況比較Table 2 Comparison of inconsistent STR genotypes between NGS results and CE ones

2.3.2 DYS392基因座分型差異分析

D-6在DYS392出現(xiàn)等位基因丟失，使用方明分析平臺重新分析同樣出現(xiàn)丟失，而測序結果未發(fā)現(xiàn)序列差異，相關文獻對該基因座均有類似報道[6-9]，等位基因越大時，等位基因數(shù)會越低甚至低于閾值。因此，考慮可能為試劑盒引物擴增效率問題。使用自行研發(fā)的高通量測序體系檢測時未發(fā)生等位基因丟失現(xiàn)象。

2.3.3 DXS7132基因座分型差異分析

基因座DXS7132在樣本A-3、A-4、A-6、A-7、A-8、A-10、A-11、D-10中顯示與CE結果不一致，出現(xiàn)了等位基因丟失的情況。通過Investigator Argus X-12 QS試劑盒驗證，結果與DNATyperTMX19試劑盒一致，如圖2a、2b。A家系中有多個樣本出現(xiàn)等位基因12的丟失，結合家系圖（圖1）進行分析，考慮可能存在家族遺傳傾向，推測A家系中祖母存在突變；而D家系中同胞姐妹D-10、D-11的父母樣本缺失，推測父親可能存在突變，同時D-11可能為假純合子，如表3所示。

表3 D-10、D-11突變來源分析Table 3 Analysis of mutation origin into D-10 and D-11

選取所有不一致樣本以及兩份一致樣本進行Sanger測序，通過與參考序列比對發(fā)現(xiàn)僅在重復區(qū)域下游第一個堿基發(fā)生G/A突變，如圖2d，其余位置均與參考序列一致，該突變不在引物結合區(qū)，因此排除擴增失敗的原因。隨后將原始測序FastQ數(shù)據(jù)用方明生物信息分析平臺進行分析，得到了與CE相一致的結果，如圖2c。因此，DXS7132基因座等位基因的缺失并非PCR擴增失敗，而是生物信息分析問題。而對于樣本D-11，通過查找二代測序側翼序列報告，證明該樣本Forenseq UAS分析結果缺失了來自父方的等位基因13，D-11的正確分型如表4所示。

表4 樣本D-11的正確分型Table 4 The correct genotyping of sample D-11

將實驗中所有女性樣本DXS7132的每條等位基因reads數(shù)占X-STR總reads數(shù)的比值繪制成折線圖，如圖3，其中藍色點為雜合子樣本每條等位基因reads數(shù)的占比，紅色、黃色和綠色點為純合子樣本的reads數(shù)占比，發(fā)現(xiàn)紅色、綠色點樣本的占比與藍色基本一致，提示其可能是雜合子的其中一條等位基因，意味著其中一條等位基因的丟失。紅色點正是出現(xiàn)等位基因丟失的樣本，而樣本D-11（綠色點）雖然與CE的結果一致，但通過折線圖也可以發(fā)現(xiàn)缺少了一條等位基因，通過這種方法可以發(fā)現(xiàn)NGS中假純合子的情況，故誠可增加NGS分析的準確性。

3 討論

二代測序結果生物信息分析的一種策略，是通過特異序列比對查找相應基因座的序列，當這些位置發(fā)生突變時，可能導致這些基因座等位基因的丟失，本次實驗中DXS7132基因座不一致的原因僅僅是3’側翼一個堿基的突變。Wang等[10]的實驗觀察到1份樣本在D7S820基因座、2份樣本在D21S11基因座出現(xiàn)等位基因的丟失，Sanger測序結果發(fā)現(xiàn)在側翼區(qū)出現(xiàn)堿基插入，通過NextGENe?軟件重新分析后，得到了正確的分型。Barrio等[11]在使用Converge 2.0軟件進行分析時，有3份樣本在Penta D基因座出現(xiàn)等位基因2.2的丟失，當使用STRait Razor和Integrative Genomics Viewer (IGV) v 2.4.16重新分析后，得到了與CE相一致的結果，分析發(fā)現(xiàn)是5’側翼區(qū)出現(xiàn)13 bp的缺失。這些與CE分型結果不一致的情況，往往發(fā)生在數(shù)據(jù)分析階段，通過更換其他不同的分析軟件（如STRait Razor、NextGENe?等）可以得到糾正。

除了生物信息分析的原因，二代測序與CE分型差異的原因還包括引物結合區(qū)突變、核心區(qū)長度計算方法差異、測序錯誤等。首先，引物結合區(qū)發(fā)生突變會造成等位基因擴增失敗，從而導致CE與二代測序結果的差異。Kwon等[12]的實驗中，1份樣本在DYS439基因座NGS結果為12/13，使用Powerplex Y23和熒光標記的NGS引物分別進行毛細管電泳，得到的分型結果分別為13和12/13，不一致的原因是引物結合區(qū)域的突變。Xue等[13]在D8S1179基因座觀察到了等位基因16的丟失，原因是反向引物結合區(qū)出現(xiàn)G/A突變。其次，毛細管電泳技術只能檢測擴增產(chǎn)物的長度，傳統(tǒng)的核心重復區(qū)長度的計算方法是產(chǎn)物長度減去固定的側翼長度，但是當側翼區(qū)域出現(xiàn)插入或缺失時，就會出現(xiàn)CE與NGS結果不一致的情況。Barrio等[11]通過二代測序在對496份無關個體的31個常染色體STR進行檢測時發(fā)現(xiàn)，其中1份樣本的D19S433基因座CE的分型為13.2/14，而NGS結果為純合子14，其原因是側翼區(qū)發(fā)生2 bp堿基的缺失。因此，二代測序實際上可以得到更為準確的結果，但同時也會導致與毛細管電泳不一致的結果。最后，測序過程中的測序錯誤也會導致錯誤分型，從而出現(xiàn)與CE不一致的結果。Liu等[14]的實驗中，F(xiàn)GA基因座的CE結果為24/26，二代測序結果中，Converge軟件分析結果為19.3/26，STRait Razor軟件分析結果為24，通過克隆測序發(fā)現(xiàn)，核心重復區(qū)下游的一段序列“TTTCTTTTTT”，用二代測序會出現(xiàn)錯誤，產(chǎn)生“TTTCTTTTTT”和“TTTTCTTTTT”兩種測序結果，等位基因24、26產(chǎn)生的401和218個reads中，有218和38個reads測序正確，因而在生物信息分析時，就出現(xiàn)錯誤的結果。

實際上，引物結合區(qū)突變、核心區(qū)長度計算方法差異以及樣本側翼區(qū)序列變化導致分型結果不一致的情況也出現(xiàn)在CE-STR試劑盒之間。Hill等[15]在比較試劑盒AmpFlSTR MiniFilerTM與Identifiler STR kits的一致性時發(fā)現(xiàn)27例不一致情況。Huaxia Platinum CEF2 Kit、SinofilerTM等試劑盒也有類似報道[16-18]。這種分型差異在實際工作中同樣要引起注意。

2020年，刑事技術標準化技術委員會發(fā)布了《法庭科學DNA二代測序檢驗規(guī)范》(GA/T1693-2020)和《序列多態(tài)STR等位基因命名規(guī)則》(GA/T1694-2020)，隨著未來命名標準和數(shù)據(jù)分析方法的進一步完善統(tǒng)一，二代測序與毛細管電泳之間分型差異的現(xiàn)象會得到改善。概言之，二代測序相較于毛細管電泳技術有很多優(yōu)勢，其在法醫(yī)學鑒定中的應用會越來越廣泛。