楊發(fā)震，李紹鵬,*，沈 松，蘇少明，李樹華，陳 康，魯志強

（1. 云南省公安廳，毒品分析及禁毒技術(shù)公安部重點實驗室，昆明 650228；2.玉溪市公安局刑事科學技術(shù)研究所，云南 玉溪 653100；3. 昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，昆明 650500）

近年來，在實際案件的檢驗鑒定中，經(jīng)常碰到嫌疑人將曲馬多、芬太尼和地芬諾酯等非法添加到中草藥或地芬諾酯單獨添加制成不同顏色的復(fù)方膠囊作為阿片類毒品戒斷藥物或新型毒品銷售的案件，并且已發(fā)生多起吸食過量導(dǎo)致死亡的案件。

曲馬多（tramadol）是一種阿片受體激動劑和常用的中樞性鎮(zhèn)痛藥，最早于1977年在德國上市，它易產(chǎn)生不良反應(yīng)且存在濫用的可能性[1-2]，其體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要是O-去甲基曲馬多（ODT）、N-去甲基曲馬多（NDT）及N,O-去甲基曲馬多（NODT）成分[3-4]，由于獲取途徑方便、價格便宜，近年已被一些不法分子作為傳統(tǒng)毒品替代品來使用[5]。芬太尼（fentanyl）血漿中的治療水平可低至1 ng/mL，藥效約為嗎啡的50～100倍、海洛因的30～50倍，是一種強效、短效的麻醉性鎮(zhèn)痛藥，主要用于外科麻醉和癌癥患者疼痛的治療，最早于20世紀70年代中期出現(xiàn)濫用，主要代謝物為諾芬太尼[6-8]。芬太尼被添加到海洛因中的歷史可追溯到1979年，目前白色海洛因、黑焦油海洛因等中均有芬太尼及類似物檢出的報告，僅在2013～2014年間，美國就有700多人死于芬太尼及類似物[9-11]。地芬諾酯（diphenoxylate）長期服用可形成依賴，常被吸毒人員作為海洛因替代品濫用，中毒量與治療量較接近且代謝產(chǎn)物地芬諾辛毒性更強，過量服用極易引起中毒甚至死亡，目前濫用的情況越來越嚴重[12-16]。有報道稱伊朗銷售的許多用作阿片類藥物戒斷藥的中草藥中，大量樣品檢出曲馬多、美沙酮和地芬諾酯成分[17]。

目前血液、血漿、尿液、毛發(fā)等生物樣品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯成分的檢驗，主要采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（LC-HRMS）、氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法（GC-HRMS）及毛細管電泳法（CE）等[4-5,7,18-26]。體外樣品如片劑、針劑溶液等所含曲馬多、芬太尼、地芬諾酯的檢驗主要采用高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法（CE）進行[27-34]。目前尚未見有對繳獲的毒品樣品尤其是中草藥毒品樣品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯三種成分同時定量測定的方法報道。

本文建立了對繳獲毒品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯同時定量分析的高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-DAD）檢驗方法，可為相關(guān)案件的檢驗鑒定提供方法上的支撐。該方法前處理簡便、準確，精密度、穩(wěn)定性好，已成功應(yīng)用于實際案件繳獲的不同顏色膠囊包裝的黃色粉末狀中草藥毒品和白色粉末狀毒品樣品的定量分析。圖1為曲馬多、芬太尼、地芬諾酯三種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1260 Infinity II液相色譜系統(tǒng)，配二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司），Purelab Flex純水系統(tǒng)（英國ELGA公司），MS 105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-50DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸曲馬多（化學對照品，約100 mg，中國藥品生物制品檢定所），鹽酸地芬諾酯（化學對照品，約50 mg，中國藥品生物制品檢定所），枸櫞酸芬太尼（國家藥品標準物質(zhì)，約100 mg，中國食品藥品檢定研究院），甲醇和乙腈（HPLC級，美國Fisher Scientific公司），磷酸（分析純，西隴科學股份有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，天津風船化學試劑科技有限公司），實驗用水為超純水。

準確配制濃度為1.0 mg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯單標標準儲備液及混標標準儲備液，-20 ℃恒溫避光保存，實驗時，用甲醇稀釋成所需濃度的單標或混標標準工作液。

1.2 繳獲的毒品樣品

案件中抽取的不同顏色膠囊包裝的毒品65份，按照膠囊顏色（膠囊帽-膠囊體）分為7種顏色：藍-白色、金-金色、棕-棕色、黑-黃色、紅-白色、黑-白色、藍-藍色，其中包括41份黃色粉末狀中草藥毒品（編為S-1至S-41號）和24份白色粉末狀毒品（編為S-42至S-65號）。

41份黃色粉末狀中草藥毒品膠囊中：有16份為藍-白色、8份為金-金色、11份為棕-棕色、6份為黑-黃色包裝；24份白色粉末狀毒品膠囊中：有5份為棕-棕色、5份為紅-白色、7份為黑-白色、7份為藍-藍色包裝。選取編為S-1號黃色粉末狀中草藥毒品和S-43號白色粉末狀毒品用于相關(guān)測試。

上述均為某市公安局禁毒部門在2019年1月至2020年3月份期間在四川、重慶、陜西、云南等地繳獲并委托本實驗室檢驗的樣品，樣品抽取后于室溫保存。

本實驗室采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對上述樣品定性檢驗后發(fā)現(xiàn)，黃色粉末狀中草藥毒品中均含有曲馬多、芬太尼和地芬諾酯成分，白色粉末狀毒品中均含有地芬諾酯成分。

1.3 樣品前處理

分別準確稱取黃色粉末狀毒品50 mg、白色粉末狀毒品10 mg，加適量甲醇超聲提取20 min后，加甲醇定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC-DAD分析。

1.4 儀器條件

色 譜 柱：Agilent Zorbax SB-C18 色 譜 柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫：30 ℃。流動相A：12 mmol/L磷酸二氫鉀（10%稀磷酸調(diào)至pH=4），流動相B：乙腈。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，23.5%B；3.0～8.0 min，37%B ；8.0～12.0 min，37%B ；12.0～18.0 min，80%B ；18.0～23.0 min，80%B ；23.0～25.0 min，23.5%B。流速：0.8 mL/min；進樣量為5 μL。檢測波長：210 nm，采集范圍：190～400 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了以0.3%磷酸溶液/乙腈、0.3%甲酸溶液/乙腈和12 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（10%稀磷酸調(diào)至pH=4）/乙腈等流動相在等度及梯度洗脫條件對待測目標物（曲馬多、芬太尼及地芬諾酯）保留時間、峰型和分離度等的影響，結(jié)果采用12 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（10%稀磷酸調(diào)至pH=4）/乙腈為流動相、梯度洗脫時該3種目標物能夠成功分離。通過對該流動相流速、梯度等條件優(yōu)化，結(jié)果在1.4所述條件下進行測試的實際樣品中（10份黃色粉末狀中草藥毒品和10份白色粉末狀毒品樣品）目標物與相鄰的雜質(zhì)成分色譜峰達到基線分離，分離度均大于1.5。在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描時，相同濃度曲馬多在210 nm處的吸收（峰面積）為220 nm的一半，地芬諾酯和芬太尼最大吸收均為210 nm，為了方便起見，最終選擇檢測波長為210 nm。圖2為曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的吸收波長，圖3為黃色粉末狀中草藥毒品、白色粉末狀毒品樣品和混標標準甲醇液（0.1 mg/mL）的典型色譜圖。

2.2 檢出限、定量限及線性測試

配制系列濃度的混標標準工作液對該3種目標化合物進行檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）測試，線性范圍使用2～700 μg/mL濃度范圍進行測試，每個濃度進行6次平行實驗。結(jié)果如表1所示，曲馬多的檢出限與定量限分別為0.5、1.0 μg/mL，芬太尼、地芬諾酯的檢出限均為0.2 μg/mL，定量限均為0.5 μg/mL；在2～700 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，R2均大于0.999。

表1 曲馬多、芬太尼、地芬諾酯的線性方程、決定系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限（n=6）Table 1 Linear equations, determination coefficients, linearity ranges, limits of detection (LODs) and limits of quantification(LOQs) for determination of tramadol, fentanyl, diphenoxylate by HPLC-DAD (n=6)

2.3 回收率測試

回收率測試采用標準加入法，并用其結(jié)果評價方法的準確性。用建立的方法測定出典型黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）原始含量，將三種不同濃度（約為S-1和S-43中各成分原始含量的80%、100%和120%）單標標準溶液準確添加到S-1和S-43樣品中，按照1.3樣品前處理后進行測定，每個濃度平行6次實驗。按照以下公式計算回收率：回收率=（測得量-原始量）/加入量×100%，結(jié)果如表2所示，S-1號中草藥毒品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的平均回收率在99.6%～105.4%間，S-43號白色粉末狀毒品中地芬諾酯的平均回收率為100.2%，所有化合物的相對標準偏差均小于1.40%，表明該方法準確性好。

表2 黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）中曲馬多、芬太尼及地芬諾酯的回收率（n=6）Table 2 Recoveries of tramadol, fentanyl and diphenoxylate derived from HPLC-DAD (Yellow powdered herbal medicine: sample 1; white powdered drug: sample 43) (n=6)

2.4 精密度測試

連續(xù)3日測定不同濃度混標標準工作液（濃度為10、100、700 μg/mL）的含量，每日平行測定6次，用相對標準偏差評估其方法的日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果如表3所示，該3種目標化合物日內(nèi)精密度（RSD%,n=6）在0.64%～1.59%間，日間精密度（RSD%,n=18）在1.19%～2.11%間，表明所建方法精密度良好。

表3 三種不同濃度條件下曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的日內(nèi)和日間精密度Table 3 Intra- and inter-day precision of three differentconcentration tramadol, fentanyl and diphenoxylate derived from HPLC-DAD

2.5 重復(fù)性測試

分別測定平行制備的黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）溶液，用校準曲線計算其含量，用相對標準偏差（RSD）表示方法的重復(fù)性。結(jié)果如表4所示，S-1和S-43中目標化合物的相對標準偏差（RSD%,n=6）在0.31%～1.43%間，方法重復(fù)性良好。

表4 黃色粉末狀中草藥毒品(S-1)和白色粉末狀毒品(S-43)中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的重復(fù)性測試(n=6)Table 4 Repeatability of tramadol, fentanyl and diphenoxylate analyzed with HPLC-DAD (Yellow powdered herbal medicine: sample 1;white powdered drug: sample 43) (n=6)

2.6 穩(wěn)定性測試

分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定制備的黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）溶液，記錄其峰面積，用相對標準偏差（RSD）表示其穩(wěn)定性。結(jié)果如表5所示，S-1和S-43中目標化合物的相對標準偏差（RSD%,n=7）在0.29%～0.87%間，表明制備的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 黃色粉末狀中草藥毒品(S-1)和白色粉末狀毒品(S-43)中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的24 h峰面積穩(wěn)定性Table 5 Peak area stability of tramadol, fentanyl and diphenoxylate determined within 24 hours with HPLC-DAD (Yellow powdered herbal medicine: sample 1; white powdered drug: sample 43)

2.7 實際樣品測定

應(yīng)用該方法對不同顏色膠囊包裝的65份實際案件樣品進行了定量分析，每份樣品平行測定2次。結(jié)果如表6所示，所有黃色粉末狀中草藥毒品中，藍-白色、棕-棕色膠囊中：地芬諾酯的含量遠低于曲馬多和芬太尼的含量，藍-白色膠囊中曲馬多和芬太尼兩者含量大致相似，棕-棕色膠囊中曲馬多含量均是芬太尼含量的2倍以上；金-金色、黑-黃色膠囊中：地芬諾酯遠高于曲馬多和芬太尼的含量，且大部分樣品芬太尼是曲馬多含量的2倍以上。所有白色粉末毒品中，紅-白色膠囊中地芬諾酯含量均低于0.19 mg/mg，棕-棕色膠囊中地芬諾酯含量均高于0.36 mg/mg，黑-白、藍-藍色膠囊中地芬諾酯含量在0.24～0.30 mg/mg間。

表6 實際案件檢材中曲馬多、芬太尼及地芬諾酯的定量結(jié)果Table 6 Quantitation of tramadol, fentanyl and diphenoxylate analyzed from an actual forensic case

3 結(jié)論

本文建立了同時定量分析繳獲毒品及非法添加的中草藥樣品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯含量的HPLC-DAD方法，該方法簡單、準確，精密度、穩(wěn)定性良好，回收率高。并將該方法成功應(yīng)用于實際案件中繳獲的毒品樣品及非法添加的中草藥樣品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯含量的檢驗，因毒品樣品種類繁多，雜質(zhì)成分差異大，該方法能否適用于其他基質(zhì)的樣品有待日后進一步研究。