孫明娜，吳孟華，陳虎彪，林敏婷，劉韻，張玲玲，張建業(yè)*

1.廣州醫(yī)科大學 藥學院/附屬第五醫(yī)院 廣東省分子靶標與臨床藥理學重點實驗室，廣東 廣州 511436；2.暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510632；3.香港浸會大學 中醫(yī)藥學院，香港特別行政區(qū)

中藥及天然產(chǎn)物在藥物開發(fā)和應用中占有舉足輕重的地位，是先導化合物的重要來源之一[1]。全球批準上市的抗癌藥物中73%非合成所得，其中47%是天然產(chǎn)物或其衍生物[2?4]。傳統(tǒng)中藥千金子是大戟科植物續(xù)隨子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟種子，用于二便不通、水腫、痰飲、積滯脹滿、血瘀經(jīng)閉[5]。其化學成分主要有脂肪油、蛋白質(zhì)、甾醇、二萜酯及游離二萜醇、香豆素等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的多種二萜類化合物千金子素（euphorbia factor，EF）L1～L25等，其中EFL1、EFL2、EFL3含量最高約占0.2%～0.4%?，F(xiàn)代藥理學及臨床研究表明，千金子中的二萜類成分具有一定的抗腫瘤活性[6?7]。

本課題組前期進行了千金子中二萜類成分的提取分離，發(fā)現(xiàn)EFL1、EFL2 和EFL3 具有明顯的抗腫瘤作用。最初，發(fā)現(xiàn)EFL1 對人口腔表皮樣癌細胞KB、口腔表皮樣癌耐藥細胞KBv200、人乳腺癌細胞MCF?7 及人乳腺癌耐阿霉素細胞MCF?7/ADR 等腫瘤細胞具有顯著的增殖抑制作用[8]；隨后發(fā)現(xiàn)EFL1 具有逆轉(zhuǎn)ATP 結合盒蛋白亞家族B 成員1（ATP?binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）介導的KBv200 及MCF?7/ADR 細胞多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的活性，但并不影響該細胞對化學治療藥的敏感性[9]；此外，EFL1 可降低抗癌藥對ABCB1高表達的人白血病阿霉素耐藥細胞K562/ADR 的半數(shù)抑制濃度（IC50），并可通過線粒體途徑增敏細胞K562/ADR 的凋亡[10]；再者，EFL1 也可增加活性氧的釋放、降低線粒體膜電位、釋放細胞色素C（cytochrome C，Cyt C），從而誘導人肺癌細胞A549的凋亡[11]。本課題組也發(fā)現(xiàn)，EFL2和EFL3 對肺癌A549 細胞有顯著的抑制作用，其作用機制與通過線粒體途徑誘導凋亡相關[12?13]。為了進一步探討千金子中的藥效物質(zhì)基礎，本研究采用超高效液相色譜?質(zhì)譜法（UPLC?MS/MS）分析與傳統(tǒng)的乙醇回流提取及色譜分離相結合的方法研究千金子乙酸乙酯提取部分的化學成分，并利用分離所得化合物的核磁共振（NMR）數(shù)據(jù)驗證UPLC?MS/MS的分析結果。

1 材料

1.1 試劑

分析純有機溶劑如乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、環(huán)己烷、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均購自廣州佳鉆生物科技有限公司；色譜純試劑如甲醇、乙腈購自廣州威佳科技有限公司；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH?20 型葡聚糖凝膠（瑞士Pharmacia Biotech 公司）；千金子購自河北安國藥材市場，經(jīng)香港浸會大學陳虎彪教授鑒定為大戟科續(xù)隨子EuphorbialathyrisL.的干燥成熟種子，標本保存于廣州醫(yī)科大學藥學院植物標本室；對照品EFL1、EFL2、EFL3為自制樣品，純度均大于99%。

1.2 儀器

1290 型超高效液相測譜儀、G6540A 型飛行時間質(zhì)譜儀（Agilent Technologies 公司）；質(zhì)譜分析軟件為Agilent MassHunter（G3336?60048）；工作站軟件為Qualitative Analysis B.06.00；Inova?500 NB 型核磁共振儀、Inova?400 NB 型核磁共振儀（美國Varian公司）。

2 方法

2.1 提取分離

取千金子藥粉16 kg，用95%乙醇（4 L·kg-1）加熱回流，提取3 次，每次3 h。合并提取液后減壓濃縮得浸膏。將浸膏混懸于蒸餾水中，依次用環(huán)己烷（4 L）和乙酸乙酯（4 L）提?。ǜ? 次）。乙酸乙酯層減壓濃縮后，進行硅膠柱色譜（石油醚?乙酸乙酯洗脫）和Sephadex LH?20 柱色譜（二氯甲烷?甲醇洗脫）分離。

2.2 樣品制備

分別稱取EFL1、EFL2、EFL3、千金子乙酸乙酯提取部分0.1 mg，溶解于10 μL三氯甲烷中，再用色譜甲醇稀釋至1 mL，得對照品溶液和供試品溶液。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ACQUITY Van Guard BEH C18色譜柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；檢測波長分別為210、230、250、280 nm；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）?0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫（0～15 min，45%～80%B；15～18 min，80%B；18～22 min，80%～45%B）；流速為1 mL·min-1；進樣體積為1.0 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

離子源為噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）；脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氣流速為7.0 L·min-1；霧化氣壓力為45 psi（1 psi≈6.895 kPa）；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為10.0 L·min-1；帽電壓為4000 V；噴嘴電壓為0 V；碎裂電壓為140 V；分離錐電壓為65.0 V；八級桿透射峰電壓為750 V。

2.5 核磁共振實驗條件

用氘代三氯甲烷（CDCl3）作為溶劑，并以四甲基硅烷（TMS）作為參考物質(zhì)；相對于TMS 的化學位移（δ）；處理分析軟件為MestReNova V12.0.0。

3 結果

3.1 UPLC?MS/MS分析

千金子乙酸乙酯提取部分和對照品（EFL1、EFL2、EFL3）的離子流色譜見圖1，千金子乙酸乙酯提取部分離子流圖中主要有12個峰。

圖1 千金子素對照品及千金子乙酸乙酯提取物的總離子流色譜

3.2 UPLC?MS/MS鑒定結構

根據(jù)每個峰對應的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結合參考文獻已報道的千金子二萜類化合物的信息[8,11,13?20]，并與對照品EFL1、EFL2、EFL3 的UPLC?MS/MS 進行對比，鑒定出12 種千金子二萜類化合物，分別為化合物1～12，鑒定結果見表1，化合物結構式見圖2。千金子中二萜成分的結構中含多個酯鍵，其質(zhì)譜信息中多為脫除中性小分子羧酸的碎片離子。在本研究所采用的離子源條件下，各化合物的分子離子及碎片離子均可檢測到加氫和加鈉離子信號，加氫信號離子的豐度更大，本研究主要通過加氫離子信號分析鑒定各化合物。分析3 種對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律，為了與參考文獻對比，故采用了加鈉離子信號。EFL3的質(zhì)譜裂解規(guī)律（圖3）：分子離子峰為m/z545［M+Na］+，脫除1 分子乙酸得m/z485；脫除2 分子乙酸得m/z425；脫除1 分子苯甲酸得m/z423；脫除1分子乙酸和1分子苯甲酸得m/z363；脫除2分子乙酸和1 分子苯甲酸得m/z303，質(zhì)譜裂解規(guī)律與參考文獻［14?15］相一致。

圖2 千金子素乙酸乙酯提取物中化合物1～12的化學結構

圖3 EFL3的質(zhì)譜裂解規(guī)律

EFL2 的質(zhì)譜裂解規(guī)律：分子離子峰為m/z665［M+Na］+，脫除1 分子乙酸得m/z605；脫除2 分子乙酸得m/z545；脫除1 分子苯甲酸得到m/z543；脫除1分子乙酸和1分子苯甲酸得m/z483；脫除2分子乙酸和1分子苯甲酸得m/z423；脫除1分子乙酸和2分子苯甲酸得m/z361；脫除2 分子乙酸和2 分子苯甲酸得m/z301（圖4），與參考文獻［14,16］相一致。

圖4 EFL2的質(zhì)譜裂解規(guī)律

EFL1 的質(zhì)譜裂解規(guī)律：分子離子峰為m/z575［M+Na］+，脫除1 分子乙酸得m/z515；脫除2 分子乙酸得m/z455；脫除1 分子苯乙酸得m/z439；脫除1分子乙酸和1分子苯乙酸得m/z379；脫除2分子乙酸和1 分子苯乙酸得m/z319（圖5），與參考文獻［14］相一致。

圖5 EFL1的質(zhì)譜裂解規(guī)律

參考EFL1、EFL2、EFL3 的質(zhì)譜裂解規(guī)律[14?16]，本研究實驗中千金子乙酸乙酯提取部分12 種化合物的總離子流色譜圖見圖1D，質(zhì)譜信息見表1。化合物1 的保留時間（tR）為8.754 min，分子離子峰為m/z539［M+H］+，分子式為C31H38O8。二級質(zhì)譜為m/z419［M+H-120］+，m/z417［M+H-122］+，m/z357［M+H-182］+，m/z297［M+H-242］+，產(chǎn)生脫去120、122、182、242 個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2個乙酸酯片段和1個苯甲酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物1為EFL25。

表1 千金子乙酸乙酯提取部分12種化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

化合物2 的tR為9.339 min，分子離子峰為m/z553［M+H］+，分子式為C32H40O8。二級質(zhì)譜為m/z493［M+H-60］+，m/z417［M+H-136］+，m/z357［M+H-196］+，m/z297［M+H-256］+，產(chǎn)生脫去60、136、196、256 個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2個乙酸酯片段和1個苯乙酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[8,11,17?19]，結合化合物2的質(zhì)譜信號與EFL1對照品在tR9.342 min 的信號一致，鑒定化合物2為EFL1。

化合物3 的tR為9.506 min，分子離子峰為m/z495［M+H］+，分子式為C30H38O6。二級質(zhì)譜為m/z435［M+H-60］+，m/z359［M+H-136］+，m/z299［M+H-196］+，產(chǎn)生脫去60、136、196個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有1個乙酸酯片段和1個苯乙酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物3為EFL13。

化合物4的tR為9.598 min，分子離子峰為m/z581［M+H］+，分子式為C33H40O9。二級質(zhì)譜為m/z521［M+H-60］+，m/z461［M+H-120］+，m/z401［M+H-180］+，m/z339［M+H-242］+，m/z279［M+H-302］+，產(chǎn)生脫去60、120、180、242、302個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有3 個乙酸酯片段和1 個苯甲酸酯片段。基于以上數(shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物4為EFL7b。

化合物5的tR為9.915 min，分子離子峰為m/z481［M+H］+，分子式為C29H36O6。二級質(zhì)譜為m/z421［M+H-60］+，m/z359［M+H-122］+，m/z299［M+H-182］+，產(chǎn)生脫去60、122、182個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有1個乙酸酯片段和1個苯甲酸酯片段。基于以上數(shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物5為EFL12或其異構體。

化合物6的tR為10.149 min，分子離子峰為m/z537［M+H］+，分子式為C32H40O7。二級質(zhì)譜為m/z477［M+H-60］+，m/z417［M+H-120］+，m/z401［M+H-136］+，m/z341［M+H-196］+，m/z281［M+H-256］+，產(chǎn)生脫去60、120、136、196、256個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2 個乙酸酯片段和1 個苯乙酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物6為EFL18。

化合物7的tR為10.842 min，分子離子峰為m/z523［M+H］+，分子式為C31H38O7。二級質(zhì)譜為m/z463［M+H-60］+，m/z403［M+H-120］+，m/z401［M+H-122］+，m/z341［M+H-182］+，m/z281［M+H-242］+，產(chǎn)生脫去60、120、122、182、242個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2 個乙酸酯片段和1 個苯甲酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，推測化合物7可能為EFL3或EFL17。

化合物8的tR為11.259 min，分子離子峰為m/z523［M+H］+，分子式為C31H38O7。二級質(zhì)譜為m/z463［M+H-60］+，m/z403［M+H-120］+，m/z401［M+H-122］+，m/z341［M+H-182］+，m/z281［M+H-242］+，產(chǎn)生脫去60、120、122、182、242個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2 個乙酸酯片段和1 個苯甲酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，推測化合物8可能為EFL3或EFL17。

為了確證化合物7和8的具體結構，利用實驗室自制的EFL3 對照品在相同色譜條件下測得tR為11.269 min，與化合物8 的tR11.259 min 非常接近，故鑒定化合物8為EFL3[13,15,17,19]，化合物7為EFL17。

化合物9的tR為11.928 min，分子離子峰為m/z549［M+H］+，分子式為C33H40O7。二級質(zhì)譜為m/z489［M+H-60］+，m/z429［M+H-120］+，m/z401［M+H-148］+，m/z341［M+H-208］+，m/z281［M+H-268］+，產(chǎn)生脫去60、120、148、208、268個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2 個乙酸酯片段和1 個肉桂酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物9為EFL7a。

化合物10的tR為12.830 min，分子離子峰為m/z517［M+H］+，分子式為C30H44O7。二級質(zhì)譜為m/z457［M+H-60］+，m/z401［M+H-116］+，m/z397［M+H-120］+，m/z341［M+H-176］+，m/z281［M+H-236］+，產(chǎn)生脫去60、116、120、176、236個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2 個乙酸酯片段和1 個正己酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[17]，鑒定化合物10為EFL23。

化合物11的tR為13.055 min，分子離子峰為m/z601［M+H］+，分子式為C36H40O8。二級質(zhì)譜為m/z541［M+H-60］+，m/z479［M+H-122］+，m/z419［M+H-182］+，m/z297［M+H-304］+，m/z279［M+H-H2O-304］+，產(chǎn)生脫去60、122、182、304、322個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有1 個乙酸酯片段和2 個苯甲酸酯片段?；谝陨蠑?shù)據(jù)和文獻報道信息[20]，鑒定化合物11為EFL11。

化合物12的tR為13.205 min，分子離子峰為m/z643［M+H］+，分子式為C38H42O9。二級質(zhì)譜為m/z583［M+H-60］+，m/z523［M+H-120］+，m/z521［M+H-122］+，m/z461［M+H-182］+，m/z401［M+H-242］+，m/z339［M+H-304］+，m/z279［M+H-364］+，產(chǎn)生脫去60、120、122、182、242、304、364 個質(zhì)量單位的碎片離子，基本可以推斷分子中含有2 個乙酸酯片段和2 個苯甲酸酯片段。基于以上數(shù)據(jù)和文獻報道信息[16?19]，結合其質(zhì)譜信號與EFL2 對照品在tR13.183 min 的信號一致，鑒定化合物12 為EFL2。

3.3 NMR鑒定結構

為了進一步證實UPLC?MS/MS 所鑒定的化合物結構，本研究進行了組分純化和NMR 結構鑒定，具體的1H?、13C?及2D?NMR（HMBC、DEPT）數(shù)據(jù)見表2?；衔?2 為從二氯甲烷中重結晶得到的無色晶體。經(jīng)高分辨質(zhì)譜分析，化合物12 的分子式為C38H42O9，m/z643.292 2［M+H］+?；衔?2的1H?NMR 譜顯示在δ7.20～8.10 有10 個芳氫信號；δ5.20～6.50有6個烯氫信號或環(huán)上連氧氫信號。13C?NMR 譜顯示有34 個碳信號；DEPT 譜顯示化合物12 有6 個甲基碳、3 個亞甲基碳、14 個次甲基碳和11 個季碳信號，提示化合物12 含有2 個單取代的苯環(huán)。13C?NMR 譜還顯示有5 個羰基碳信號，其中1 個酮羰基碳δ197.3（C?14），2 個乙酰氧基碳δ169.4、169.1，2 個苯甲酰基碳δ165.8、165.3，4個連氧的碳δ64.0（C?5）、78.4（C?7）、79.4（C?3）、91.8（C?15）。HMBC 圖譜（圖6）上可觀察到C?3 位質(zhì)子δH5.74 與δC47.7（C?1），δC165.8（C?1′），δC91.8（C?15）相關，提示C?3 位連接了苯甲酰氧基；C?5 位質(zhì)子δH6.36 與δC52.7（C?4），δC141.8（C?6），δC91.8（C?15），δC169.1（5?AcCO）相關，提示C?5 位連接了乙酰氧基；剩余的1 個乙酰氧基和1 個苯甲酰氧基連在C?7 和C?15 位，結合文獻［16?19］報道信息，C?15 位應連接乙酰氧基，C?7 位應連接苯甲酰氧基。此外，C?7 位質(zhì)子δH5.51 與δC64.0（C?5），δC141.8（C?6），δC28.6（C?8），δC31.3（C?9），δC119.5（C?17）相關；C?20位質(zhì)子δH1.78與δC142.5（C?12），δC135.3（C?13），δC197.3（C?14）相關；C?16 位質(zhì)子δH0.90與δC47.7（C?1），δC37.4（C?2），δC79.4（C?3）相關。以上數(shù)據(jù)顯示，化合物12 的2D?NMR 數(shù)據(jù)與文獻報道的EFL2的數(shù)據(jù)一致[16?19]。

圖6 化合物12的化學結構及主要HMBC（H→C）

表2 化合物12的13C-NMR、DEPT、1H-NMR及HMBC數(shù)據(jù)

4 討論

傳統(tǒng)提取分離是研究天然產(chǎn)物中化學成分的常用方法，而UPLC?MS/MS 是研究天然產(chǎn)物中復雜成分的有效方法[14]。本研究將兩者結合用于研究千金子中的活性成分，對乙酸乙酯提取部分進行UPLC?MS/MS 分析，得到12 個成分，根據(jù)相對分子質(zhì)量、分子式以及各碎片離子的信息，并與文獻報道的千金子中已知二萜類成分進行比對，鑒定上述12 種千金子二萜成分?；衔? 和2 的質(zhì)譜信息中均含有m/z297，推測其含有母核A（脫除3 分子水后得m/z296 的片段）（圖7），根據(jù)脫除的2 個質(zhì)量單位為60 的中性小分子可知其均含2 個乙?；?，此外，化合物1 中含有1 個苯甲?；?，化合物2 中含有1 個苯乙?；瑱z索相關類似物，發(fā)現(xiàn)含有此類母核的化合物中，乙?；挥? 和15 位，再結合相對分子質(zhì)量判斷化合物1 為EFL25，化合物2 為EFL1。同理，化合物3 和5 的質(zhì)譜信息中均含有m/z299，推測其含有母核B（脫除2分子水后得相對分子質(zhì)量為298 的片段）（圖7），根據(jù)脫除的1 個質(zhì)量單位為60 的中性小分子可知其均含1 個乙?；?，此外，化合物3 中含有1 個苯乙?；?，化合物5 中含有1 個苯甲?；?，經(jīng)檢索相關類似物，發(fā)現(xiàn)含有此類母核的化合物中，苯乙?；霈F(xiàn)于3位，故判斷化合物3為EFL13；苯甲?；晌挥? 位和15 位，故判斷化合物5 為EFL12 或其異構體?；衔?、11 和12 的質(zhì)譜信息中均含有m/z279，推測其含有母核C 或F（脫除4分子水后得相對分子質(zhì)量為278的片段）（圖7），根據(jù)脫除的3 個質(zhì)量單位為60 的中性小分子可知化合物4 中含有3 個乙酰基和1 個苯甲?；?jīng)檢索，含母核F的化合物中均不具有3個乙?；?，故化合物4的母核應為C，結合相對分子質(zhì)量，判斷其為EFL7b；根據(jù)脫除的2 個質(zhì)量單位為122 的中性小分子可知化合物11 和12 中含有2 個苯甲?；?，經(jīng)檢索，含母核F的化合物含有2個苯甲?；?，且苯甲?；謩e位于3位和7位，結合相對分子質(zhì)量判斷化合物11 為EFL11，化合物12 為EFL2，且化合物11 和12在UPLC?MS中保留時間較長，可能是因為含2個苯甲酰基導致極性較小?；衔?～10 的質(zhì)譜信息中均含有m/z281，推測其含有母核D 或E（脫除3 分子水后得相對分子質(zhì)量280的片段）（圖7），根據(jù)脫除的中性小分子可知化合物6、9、10 中分別含有1個苯乙?；?、肉桂酰基、正己?；?，經(jīng)檢索，含母核D 的化合物中3 位可見苯乙?；⑷夤瘐；驼乎；?，故判斷化合物6、9、10 分別為EFL18、L7a 和L23；化合物7 和8 在UPLC?MS/MS 中具有相同的相對分子質(zhì)量和碎片離子信息，本文通過對照品比對將化合物8 鑒定為EFL3，將化合物7 鑒定為EFL17。NMR 技術廣泛用于化合物的結構確證，本文也通過NMR 證實了UPLC?MS/MS 的鑒定結果，即化合物12 為EFL2。本文研究表明，基于對照樣品的UPLC?MS/MS 分析法結合傳統(tǒng)提取分離法是用于研究千金子乙酸乙酯提取部分化學成分的有效方法。

圖7 推測的12種成分所含的萜類母核