帥 婷，劉 娟，郭艷艷，金嬋媛△

(1.北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院第二門診部，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，口腔生物材料和數(shù)字診療裝備國家工程研究中心，口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，國家衛(wèi)生健康委員會口腔醫(yī)學計算機應用工程技術(shù)研究中心，國家藥品監(jiān)督管理局口腔生物材料重點實驗室，北京 100081； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院口腔科，北京 100050)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類來源于骨髓的多能干細胞，主要的生物學特點是自我更新和多向分化潛能，在特定條件下可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。在骨組織內(nèi)部，BMSCs存在著成骨向、成脂向分化之間相互制約、相互轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡，成骨-成脂肪平衡的打破將導致骨內(nèi)的病理狀況如骨質(zhì)疏松癥等骨病的發(fā)生[1]，因此，成骨-成脂肪分化平衡對于維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究表明，成骨-成脂肪分化過程通常由多種轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳因子共同調(diào)控,如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2，RUNX2)。目前BMSCs成骨向分化的研究已受到較多學者的關(guān)注，而成脂向分化的研究對于理解BMSCs成骨-成脂分化失調(diào)以及治療骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)等骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)疾病同樣重要。

隨著高通量測序及分子生物學技術(shù)的進步，學者們逐漸發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)通過表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方式在細胞生理性活動及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。近年來，研究顯示lncRNA在間充質(zhì)干細胞成脂向分化過程中也起著重要調(diào)控作用[3]。Luan等[4]研究發(fā)現(xiàn)脂肪基質(zhì)細胞成脂分化前后，有2 868個基因表達水平發(fā)生變化，其中207個是非編碼RNA。Liu等[5]研究者發(fā)現(xiàn)，lncRNATINCR通過TINCR/miR-31-5p/CEBP/α調(diào)控人脂肪間充質(zhì)干細胞成脂向分化。

MIR4697宿主基因(MIR4697host gene，MIR4697HG)，又稱為LINC00947，位于11號染色體上。以往的報道顯示，MIR4697HG與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn)MIR4697HG可以通過miR-766-5p調(diào)控膠質(zhì)瘤的形成和進展。Zhang等[7]研究顯示MIR4697HG可能通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白激酶B信號通路促進卵巢癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但MIR4697HG對BMSCs成脂向分化的影響目前還未見報道，因此，本研究旨在初步探究MIR4697HG對BMSCs成脂向分化的調(diào)控作用，為提高BMSCs成脂向分化能力，治療成骨-成脂紊亂相關(guān)的骨類疾病提供新思路。

1 資料與方法

1.1 BMSCs的體外培養(yǎng)和成脂誘導

原代人BMSCs從美國Science Cell公司購買(貨號：21580)，本細胞出廠前經(jīng)過廠家內(nèi)部標志蛋白免疫熒光染色鑒定及分化能力檢測，運輸過程中采用干冰凍存。細胞傳至第3代用于實驗，細胞培養(yǎng)在含5%CO2(體積分數(shù))的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。增殖培養(yǎng)基(proliferation medium，PM)包括改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)、10%(體積分數(shù))胎牛血清(Gibco公司，美國)、1%(質(zhì)量分數(shù))青-鏈霉素(Gibco公司，美國)。成脂誘導培養(yǎng)基(adipoge-nic medium，AM)是在PM中添加200 μmol/L吲哚美辛(Sigma-Aldrich公司，美國)、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma-Aldrich公司，美國)、10 μmol/L胰島素(Sigma-Aldrich公司，美國)和100 nmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich，美國)。細胞每2 d換1次液，在AM中培養(yǎng)7或14 d后收集細胞，進行成脂驗證實驗，包括實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)、油紅O染色及蛋白質(zhì)印跡實驗(Western blot)， 所有細胞實驗均重復3次以上。

1.2 qRT-PCR

根據(jù)TRIzol(Invitrogen公司，美國)說明書提取細胞的總RNA。通過PrimeScriptTMRT(Takara公司，日本)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后根據(jù)SYBR Green Master Mix(Roche Applied Science公司，德國)的說明書，通過ABI Prism 7500實時PCR(Applied Biosystems公司，美國)進行qRT-PCR。qRT-PCR反應結(jié)束后，確定各基因的擴增循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)值，并以內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的表達水平為參照物，評估目的基因的相對表達量，結(jié)果使用ΔΔCt法分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.3 慢病毒感染BMSCs

設(shè)計3組慢病毒序列，分別為MIR4697HG敲減序列1(shMIR4697HG-1)、MIR4697HG敲減序列2(shMIR4697HG-2)及其對照(shNC，表2)，慢病毒MIR4697HG敲減載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

取第3代的BMSCs進行實驗，將細胞接種至培養(yǎng)皿中，待細胞長滿50%時進行慢病毒感染，根據(jù)感染說明書其感染復數(shù)(感染時病毒與細胞數(shù)量的比值)為50，慢病毒滴度為3×107TU/mL；為促進感染效率，加入5 mg/L聚凝胺，感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)病毒轉(zhuǎn)染情況，分為3組：(1)陰性對照組(shNC組)：感染無序列質(zhì)粒載體慢病毒的BMSCs；(2)實驗組1:感染shMIR4697HG-1慢病毒的BMSCs(shMIR4697HG-1組)；(3)實驗組2:感染shMIR4697HG-2慢病毒的BMSCs(shMIR4697HG-2組)。由于慢病毒攜帶的質(zhì)粒載體可以表達綠色熒光蛋白及嘌呤霉素抗性基因，因此72 h后通過使用1～5 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)的BMSCs，并通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。

表2 shRNA 靶序列Table 2 shRNA sequences of lentiviruses

1.4 Western blot

細胞培養(yǎng)皿去掉培養(yǎng)基，用預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3次，加入適量的放射免疫沉淀測定(radioimmune precipitation assay，RIPA)裂解液及蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)提取細胞總蛋白。通過二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)定量檢測試劑盒(Thermo公司，美國)測量蛋白濃度。通過計算取30 μg蛋白，加入5×上樣緩沖液，將樣品配成30 μL的蛋白上樣體系，電泳分離蛋白，在100 V恒壓冷室轉(zhuǎn)膜90 min，用5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛奶封閉，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜加一抗PPARγ(Cell Signaling Technology公司，美國)、CEBP/α(Cell Signaling Technology公司，美國)，置于4 ℃冷室搖床上過夜孵育；在PVDF膜中加入對應的二抗(Cell Signaling Technology公司，美國)，室溫條件下孵育1 h，采用超敏ECL發(fā)光液(康為世紀公司，中國)孵育，在化學顯影機器曝光記錄條帶。

1.5 油紅O染色

BMSCs接種于12孔板，培養(yǎng)14 d后用PBS清洗3次，用10%(質(zhì)量分數(shù))甲醛固定30 min。然后用60%(體積分數(shù))異丙醇潤洗細胞。加入油紅O溶液(Sigma-Aldrich公司，美國)，室溫孵育10 min，棄去染液，顯微鏡下觀察和成像。染色細胞用100%(體積分數(shù))異丙醇洗脫，用于定量評價。100%(體積分數(shù))異丙醇為空白對照，在500 nm波長下測量光密度值。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有統(tǒng)計分析由PRISM軟件進行，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。兩組比較使用雙側(cè)獨立樣本t檢驗，多組比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MIR4697HG在BMSC成脂肪分化中上調(diào)

在BMSCs成脂誘導的0、1、2、3、5、7、10 d分別收集細胞提取RNA進行qRT-PCR實驗，結(jié)果顯示與成脂誘導的0 d相比，MIR4697HG同成脂肪相關(guān)基因PPARγ、CEBP/α和ADIPQ的表達趨勢相似，隨著成脂誘導時間的延長逐漸增加(P<0.01，圖1)。

BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells; The other abbreviations as in Table 1．* P<0.05, vs. 0 d; A, the expression level of MIR4697HG after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs; B, the expression level of PPARγ after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs; C, the expression level of CEBP/α after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs; D, the expression level of ADIPQ after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs.圖1 BMSCs成脂誘導后MIR4697HG和成脂相關(guān)基因的表達水平Figure 1 Expression level of MIR4697HG and adipogenesis-related genes after adipogenic induction in BMSCs

2.2 構(gòu)建MIR4697HG敲減的BMSCs細胞系

為防止脫靶效應，本研究使用了兩條不同序列的shRNA(shMIR4697HG-1，shMIR4697HG-2)。慢病毒感染BMSCs 72 h后，熒光顯微鏡下可以觀察到90%以上細胞成功表達綠色熒光蛋白(圖2A)，qRT-PCR進一步證實MIR4697HG敲減效率高于60%(圖2B)。

2.3 敲減MIR4697HG抑制BMSCs成脂向分化

在MIR4697HG敲減細胞及其對照細胞(shNC)成脂誘導7 d后提取RNA進行qRT-PCR實驗，結(jié)果顯示敲低MIR4697HG后，成脂相關(guān)基因PPARγ、CEBP/α和ADIPQ的mRNA水平顯著降低(圖3A)。Western blot結(jié)果同樣顯示PPARγ、CEBP/α的蛋白表達水平在MIR4697HG敲減BMSCs中顯著降低(圖3B)。油紅O染色實驗顯示，成脂誘導14 d時，敲減MIR4697HG的細胞所形成的紅色脂滴較shNC細胞明顯減少，油紅O染色定量結(jié)果同樣證明敲減MIR4697HG后細胞成脂能力下降(圖3C)。

GFP, green fluorescent protein;MIR4697HG, MIR4697 host gene.*P<0.05; vs. shNC group; A, the transfection effect was observed by fluorescence microscopy 24 hours after shMIR4697HG-1 group, shMIR4697HG-2 group and shNC group transfection；B, the transfection efficiency of MIR4697HG was examined by qRT-PCR.圖2 慢病毒感染效果和敲減效率檢測Figure 2 Examination of lentivirus transfection effect and efficiency

3 討論

隨著老齡化社會的到來，OP的發(fā)病率逐年上升[8]。OP是以骨量減少，骨組織微細結(jié)構(gòu)破壞導致骨脆性增加的一種系統(tǒng)性全身性骨骼疾病。目前治療OP的藥物主要分為3類，包括促進成骨細胞(如雙磷酸鹽類、雌激素及其受體調(diào)節(jié)劑類等)、抑制破骨細胞(如特立帕肽、阿巴帕肽等)和雙向作用藥物(促進成骨細胞同時抑制破骨細胞，如羅莫索單抗、雷尼酸鍶等)， 但這些藥物副作用較大，治療效果有限，給患者的身心及社會帶來較大的負擔[9]。

BMSCs是一類從骨髓中分離提取的成體干細胞，其在骨內(nèi)可以向成骨細胞和脂肪細胞分化。正常的骨組織內(nèi)，骨髓間充質(zhì)干細胞在成骨及成脂向分化時存在著一定的平衡關(guān)系。當BMSCs成骨向分化減少，成脂向分化增多時，可引起OP等疾病的進展。目前研究發(fā)現(xiàn)多種信號通路參與了BMSCs的成骨/成脂分化過程，包括Wnt/β-catenin[10]、RANKL/RANK[11-12]、TGFβ/Smad[13]、ERK[14]、NF-κB和MAPK[15]等。然而BMSCs成骨/成脂分化過程復雜，是一個多步驟、多基因、多因素的過程，是否受到特定關(guān)鍵分子或信號通路的調(diào)控尚不清楚，目前仍有很多未知的分子機制[16-17]，因此，探索BMSCs的成骨/成脂向分化的機制對于預防和治療骨質(zhì)疏松等疾病具有重要的指導意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在間充質(zhì)干細胞成骨分化及成脂向分化中起到不同的調(diào)控作用[18-20]。部分研究指出lncRNA促進BMSCs成骨向分化，lncRNATCONS_00041960作為miR-204-5p和miR-125a-3p的競爭性內(nèi)源性RNA參與調(diào)控BMSCs的成骨/成脂分化平衡[18]。TCONS_00041960過表達促進RUNX2、osterix等成骨基因的表達，而抑制成脂相關(guān)基因的表達[18]。也有研究指出lncRNAH19作為miR-188海綿，調(diào)節(jié)LCOR表達，進而參與調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells，mBMSCs)成骨和成脂向分化[19]，而有些研究則發(fā)現(xiàn)部分lncRNA促進BMSCs成脂向分化，如lncRNAORLNC1作為miR-296的競爭性內(nèi)源RNA，抑制BMSCs成骨向分化，促進BMSCs成脂向分化，ORLNC1在卵巢切除術(shù)誘導骨質(zhì)疏松癥小鼠的血液及骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織中表達顯著增加[20]。另一項研究顯示，在小鼠體內(nèi)抑制lncRNAPPARγ輔活化子-1β-OT1將促進骨組織內(nèi)脂肪堆積，抑制成骨細胞分化[21]。

本研究顯示lncRNAMIR4697HG在BMSCs成脂分化中明顯增加，敲減能夠抑制BMSCs表達PPARγ和CEBP/α，這在一定程度上闡釋了OP等成脂肪異常疾病的發(fā)病機制并為制定治療策略提供了一定的理論基礎(chǔ)，但是更為詳細的分子機制仍需進一步研究。

PM, proliferation medium; AM, adipogenic medium; BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells; The other abbreviations as in Table 1; *P<0.05; vs. shNC group; A, qRT-PCR results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs; B, Western blot results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs; C, oil red staining results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs.圖3 敲減MIR4697HG抑制BMSCs成脂分化的檢測結(jié)果Figure 3 Results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs