丁婷婷，曾楚雄，胡麗娜，余明華

(上海市浦東醫(yī)院，復旦大學附屬浦東醫(yī)院腫瘤科，上海 201399)

盡管結(jié)直腸癌的篩查、診斷和根治性切除術(shù)目前已取得了進展，但其仍是全球范圍內(nèi)癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。大約20%～25%新確診的結(jié)直腸癌患者存在遠處轉(zhuǎn)移，且其中只有一小部分可以接受根治性手術(shù)[2]。此外，大約50%的結(jié)直腸癌患者具有可切除指征，其中多數(shù)會在切除后2年內(nèi)復發(fā)[3]。在過去的幾十年里，人們不斷地對腫瘤細胞的基因組和生物學變化進行研究，識別具有不同預后和治療反應的患者亞群，并尋找潛在的藥物治療靶點[4]。然而，腫瘤的惡性表型不僅由腫瘤細胞的內(nèi)在活性決定，還由腫瘤相關微環(huán)境中募集和激活的免疫細胞決定。

腫瘤浸潤性免疫細胞(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)的功能和組成會根據(jù)宿主的免疫狀態(tài)發(fā)生微妙的變化，可被藥物有效靶向并與臨床預后相關[5]。相關機制研究證實，在TIICs與腫瘤基質(zhì)中的惡性細胞之間存在著復雜的相互作用，這種相互作用具有顯著的預后相關性，免疫系統(tǒng)可通過支持宿主防御或腫瘤進展而發(fā)揮雙重作用[6]。然而，即使在具有相同實驗設計的研究中，某些TIICs亞群的預后價值也不總是保持一致，比如白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)已被證明在腫瘤的進展中具有雙重作用，IL-17+T細胞的功能和預后價值在不同的研究中相互矛盾[7-8]。上述有矛盾結(jié)果的研究均局限于免疫反應觀點，其基于免疫組織化學方法分析評估TIICs，僅依賴于單個標記識別一個特定的TIICs亞群，但因為許多標記蛋白可在不同細胞類型中表達，該方法可能不夠全面。

CIBERSORT是一種基于基因表達的反卷積算法，其被用于評估一組基因相對于樣本中所有其他基因的相對表達變化[9-10]，可用于確定TIICs的多樣性。由于CIBERSORT的優(yōu)越性能，其在細胞異質(zhì)性研究中的應用越來越受到關注。因此，本研究應用CIBERSORT來量化參與結(jié)直腸癌免疫反應的22個TIICs亞群，以研究其與5年生存率之間的關系，希望能為結(jié)直腸癌TIICs異質(zhì)性、腫瘤分子亞型及疾病進展之間的復雜關系提供一些信息。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與數(shù)據(jù)分析

本研究利用美國國家生物信息技術(shù)中心TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)，檢索條件設定如下：(1)案例選項：基本位點為“結(jié)直腸癌(設定病理分型為腺癌)”，其余條目默認系統(tǒng)設定；(2)文件選項：數(shù)據(jù)分類為“轉(zhuǎn)錄組分析”，數(shù)據(jù)類型為“基因表達定量”，實驗策略為“轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)”，工作流程類型為“HTSeq計數(shù)”，其余條目默認系統(tǒng)設定。下載截至2020年7月1日上傳的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者基因表達譜和臨床信息，下載得出的腫瘤組織和配對的正常組織進行后續(xù)差異分析。

1.2 TIICs與臨床特征的關系分析

通過CIBERSORT算法預測結(jié)直腸癌組織及正常對照組織基因表達譜中22種TIICs基因的表達水平來確定其基因組成，進行基因表達分析，再將基因的表達轉(zhuǎn)化為免疫細胞水平，得出腫瘤組織和正常組織樣本中TIICs的組成和比例，計算每個樣本的標準差和CIBERSORTP值以提高CIBERSORT的準確性，并篩選出P<0.05的樣本進行臨床分析，將過濾后的免疫細胞矩陣與臨床數(shù)據(jù)合并，探討免疫細胞與臨床特征之間的關系。最后篩選差異浸潤的免疫細胞，計算免疫細胞水平與患者生存的相關性，并繪制生存曲線圖。

1.3 統(tǒng)計分析

所有分析均通過R軟件(3.5.2版)進行，符合正態(tài)分布的連續(xù)變量用均數(shù)和標準差描述，非正態(tài)分布資料用中位數(shù)(P25，P75)描述，分類變量用頻數(shù)和百分數(shù)表示。將CIBERSORTP<0.05的樣本納入下一步分析。使用Pearson相關分析得出不同免疫細胞亞型之間的相關性，通過corrplot R包評估不同類型免疫細胞之間的關系，生存R包用于執(zhí)行Kaplan-Meier曲線， 應用Wilcoxon檢驗分析免疫細胞和臨床特征之間的相關性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者臨床資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫共下載符合設定條件的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)514個(包括473例結(jié)直腸癌樣本和41個正常對照樣本)，其中結(jié)直腸癌患者中位年齡69(58，77)歲，其他基本臨床資料見表1。

2.2 結(jié)直腸癌組織TIICs的分布

共有6個正常樣本和118個腫瘤樣本符合CIBERSORTP<0.05。使用CIBERSORT對正常組織與結(jié)直腸癌組織中22個TIICs亞群進行分析，繪制條形圖，以不同顏色顯示每個各組織樣本中免疫細胞的比例，條形的長度表示該細胞水平。從圖1可以看出，結(jié)直腸癌組織中M0、M1和M2巨噬細胞和單核細胞的比例相對較高，約占22個TIICs亞群的60%；相反，B細胞和中性粒細胞的比例相對較低，約占10%。我們推斷 TIICs比例的差異可能是個體差異的基本特征并具有預后價值。

進一步繪制出的矩陣圖提示，濾泡輔助性T細胞和M1巨噬細胞(r=0.53)、單核細胞和靜息肥大細胞(r=0.46)、靜息自然殺傷(natural killer，NK)細胞和CD4+T細胞等呈顯著正相關，CD4+T細胞和M0巨噬細胞(r=-0.53)、M1巨噬細胞和M0巨噬細胞(r=-0.46)、CD4+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(r=-0.42)等呈顯著負相關(圖2)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者一般臨床特征Table 1 General clinical characteristics of colorectal cancer patients in the TCGA database

2.3 結(jié)直腸癌組織TIICs比例與臨床特征的關系

部分TIICs的比例與患者的TNM分期及臨床分級顯著相關：T1～T2期患者靜息NK細胞和CD8+T細胞水平高于T3～T4期(P<0.05)，T3～T4期患者漿細胞比例高于T1～T2期(P<0.05)；活化樹突狀細胞在N0期的比例高于N1～N2期(P<0.05)；M0期患者M1巨噬細胞水平高于M1期患者，而M1期患者激活的肥大細胞水平更高(P<0.05)。此外，M1巨噬細胞和單核細胞在臨床分級Ⅰ和Ⅱ級患者中均處于高表達水平(P<0.05，圖3)。

2.4 不同TIICs表達程度與患者5年生存率之間的關系

Kaplan-Meier曲線顯示，結(jié)直腸癌患者的預后部分受個體TIICs亞型差異的影響：活化的樹突狀細胞表達越高，結(jié)直腸癌患者的5年生存率越高；但幼稚的CD4+T細胞則相反，其表達越高，患者的5年生存率越低(P<0.05，圖4)。這意味著TIICs特征可以為治療策略提供更多的預后價值。

3 討論

除了惡性腫瘤細胞，腫瘤組織也包括免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞，以及細胞因子、趨化因子、生長因子等多種分子[11]。這些成分及其復雜的相互作用形成了腫瘤相關微環(huán)境，該微環(huán)境甚至可以對侵襲性惡性腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用，但在其進展過程中，腫瘤細胞可能會繞過這些抑制信號，而是利用免疫細胞和其他細胞為自己謀取利益，從而繼續(xù)生長、侵襲、轉(zhuǎn)移[12-14]。在腫瘤微環(huán)境中募集和激活的主要宿主細胞是各種免疫細胞，眾所周知，免疫系統(tǒng)同時具有促癌和抑癌作用，腫瘤基質(zhì)中的免疫細胞和惡性腫瘤細胞之間實際上存在著一個復雜的生物學過程，并具有顯著的預后相關性[15]。在結(jié)直腸癌中，不同類型免疫細胞的分布、組織定位、細胞類型均與腫瘤進展顯著相關。與TIICs高浸潤組相比，低浸潤組臨床Ⅲ期結(jié)直腸癌患者5年生存率和無病生存期(disease-free survival，DFS)顯著降低[16]。此外，直腸癌活檢中TIICs的高浸潤與改善腫瘤對術(shù)前放化療的反應相關，并與延長的DFS和總生存期(overall survival，OS)顯著相關。這些結(jié)果提供的證據(jù)表明，TIICs高浸潤不僅是一個有利的預后因素，而且還可以預測化療的結(jié)果。

作為一種免疫敏感性腫瘤，結(jié)直腸癌被異質(zhì)性的TIICs集合浸潤，包括T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞，此外，結(jié)直腸癌內(nèi)TIICs的類型、密度和位置對預后的判斷有很大價值[17]。例如，Klintrup等[18]評估了直腸癌患者的整體炎癥細胞反應及各種TIICs密度，其免疫組織化學實驗表明，浸潤邊緣的炎癥反應是OS和DFS的重要預測因子。此外，成熟T細胞、樹突狀細胞和記憶T細胞通?？沙霈F(xiàn)在預后良好的結(jié)直腸癌患者TIICs亞群中，而免疫抑制性調(diào)節(jié)性T細胞則與結(jié)直腸癌的預后不良相關[19]。最近的幾項研究甚至指出，與目前用于結(jié)直腸癌分期的組織病理學方法相比，免疫學數(shù)據(jù)(腫瘤樣本中免疫細胞的類型、密度和位置)可以更好地預測患者的存活期[20]。

Different colors represent different immune cells, and the length of the bars in the bar graph represents the level of immune cell populations.圖1 結(jié)直腸癌和正常組織樣本中免疫細胞比例Figure 1 The proportion of immune cells in each colorectal cancer and normal tissue sample

Some immune cells were negatively related, represented in blue, and others were positively related, represented in red. The darker the colour, the higher the correlation was.圖2 22種TIICs比例的相關矩陣Figure 2 Correlation matrix for all 22 TIICs proportions

圖3 TIICs與結(jié)直腸癌TNM分期和臨床分級的關系Figure 3 Relationship between TIICs and TNM stage and clinical stage of colorectal cancer

A, activated dendritic cells; B, na?ve CD4+T cells.圖4 與5年生存率顯著相關的特定免疫細胞群的生存曲線Figure 4 Survival curves of specific immune cell populations with significantly correlated five-year survival rate

本研究應用CIBERSORT評估了結(jié)直腸癌及正常組織的免疫細胞浸潤模式，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中浸潤水平較高的免疫細胞類型為B細胞、漿細胞、CD4+T細胞、NK細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞、活化肥大細胞等，并發(fā)現(xiàn)活化的樹突狀細胞與結(jié)直腸癌患者的5年總生存率正相關。樹突狀細胞是體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞，在機體的抗腫瘤免疫應答中發(fā)揮著重要作用。體內(nèi)未成熟樹突狀細胞在攝取外來抗原后轉(zhuǎn)化成熟，通過主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC) Ⅰ和Ⅱ分別與CD8+T細胞和CD4+T細胞相互作用，誘發(fā)免疫反應[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，相比藥物治療，肝癌患者在術(shù)后接受樹突狀細胞疫苗以及活化的T細胞治療，患者的OS明顯延長，以其為基礎的腫瘤免疫治療將有可能成為最有效的療法之一[22]。

本研究結(jié)果顯示，幼稚CD4+T細胞是結(jié)直腸癌中浸潤比例相對較高的免疫細胞，其與結(jié)直腸癌患者5年生存率呈負相關。有研究證實，機體抗腫瘤的免疫效應主要為T細胞介導的特異性細胞免疫反應[23]。相較于正常組織，結(jié)直腸癌組織中幼稚CD4+T細胞數(shù)量明顯減少。一方面，當幼稚CD4+T細胞減少后，誘導針對腫瘤的免疫應答減弱，利于腫瘤的生長；另一方面，腫瘤細胞通過抑制記憶性T淋巴細胞的表達，逃避機體的監(jiān)視，利于腫瘤細胞發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移[24]。

盡管本研究已經(jīng)用統(tǒng)計方法來消除隊列偏差，但這些數(shù)據(jù)的異質(zhì)性仍然在一定程度上阻礙了可重復性。由于本研究選擇的病例數(shù)量有限，在對結(jié)直腸癌患者進行生存分析時有一定的局限性。隨著數(shù)據(jù)庫的完善，可以進一步增加樣本量并延長隨訪時間，以更準確地評估預后。本研究對結(jié)直腸癌患者TIICs亞群的分析揭示了其與臨床結(jié)果的重要關聯(lián)，這些關聯(lián)將有助于識別可能從化療中受益的患者，并預測新藥的可能靶點。將可靠的反卷積算法與大規(guī)模基因組數(shù)據(jù)相結(jié)合，能進一步揭示構(gòu)成結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的非腫瘤細胞的臨床和生物學意義。探索免疫細胞指標的異質(zhì)性對于結(jié)直腸癌預后預測乃至未來的個體化治療勢在必行。