陳國峰，賈金蓉，李雪茹，廖 輝，張曉波，劉 峰，董見南

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086）

玉米是我國北方地區(qū)的主要糧食作物，能夠為食品加工提供豐富的原材料，促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展。玉米生長過程中易發(fā)生各種病蟲草害，如玉米發(fā)苗階段的主要蟲害是黏蟲等，心葉階段的主要有害生物是草地貪夜蛾、玉米螟、蚜蟲和紅蜘蛛等[1-2]，狗尾草、稗草、藜和反枝莧是玉米生長過程中的主要雜草[3]。

撲草凈，又叫撲滅通，是選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，其主要被根部吸收，在植物體內(nèi)運(yùn)輸傳導(dǎo)到植物葉片，也可從莖葉進(jìn)入植物體內(nèi)[4-5]。撲草凈作用機(jī)理是抑制植物光合作用中電子的傳遞。雜草中毒癥狀首先是葉片由外向內(nèi)逐漸失綠，最終全株枯死[6-8]。乙草胺屬于芽前除草劑，由美國孟山都公司于1971年研發(fā)成功，是目前世界上最重要的除草劑品種之一，也是目前我國使用量最大的除草劑之一，可防除一年生禾本科雜草和某些一年生闊葉雜草[9-10]。乙草胺作用機(jī)理是抑制α-淀粉酶活性，影響赤霉素、蛋白酶的合成及細(xì)胞膜通透性等[11-12]。異 唑草酮是一種選擇性內(nèi)吸型苗前除草劑，主要用于玉米、甘蔗等旱作物，可防除多種一年生闊葉雜草和一些禾本科雜草[13]。異 唑草酮被噴到土壤中后迅速水解為異 唑草酮代謝物（異 唑草酮-二酮腈）[14]。異 唑草酮-二酮腈通過抑制對羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶的合成，進(jìn)而影響到類胡蘿卜素的生物合成，最終使雜草出現(xiàn)失綠、生長停止和壞死等癥狀[14]。將撲草凈、乙草胺和異 唑草酮復(fù)配，可擴(kuò)大復(fù)配藥劑對春玉米田一年生雜草的殺草譜及提高防效。

大量研究報道了撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的藥效、環(huán)境行為以及檢測方法等[15-18]，而目前有關(guān)同時測定青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈殘留方法的研究較少。此外，有關(guān)田間條件下聯(lián)合處理撲草凈、乙草胺和異 唑草酮及其代謝物的殘留和風(fēng)險評估的報道較少。因此，本研究的目的是：（1）建立一種簡單、快速、有效的分析方法，通過UPLC-MS/MS測定青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的殘留量；（2）研究田間施用78%撲草凈·乙草胺·異 唑草酮SE在青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈中的最終殘留；（3）評估撲草凈、乙草胺和異 唑草酮在膳食中的攝入風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品撲草凈（純度99.7%）、乙草胺（純度99.4%），上海市農(nóng)藥研究所有限公司；異 唑草酮（純度99.6%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；異 唑草酮-二酮腈（純度99.5%），美國CHEM SERVICE公司。乙腈、丙酮和乙酸銨均為色譜純、有機(jī)系濾膜（0.22μm），北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心；乙腈、氯化鈉均為分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；石墨化碳黑（GCB）、N-(正丙基)乙二胺（PSA），天津艾杰爾科技有限公司。

X-TQS三重四極桿質(zhì)譜，配有電噴霧離子源（ESI），美國沃特世公司；BT 2202 S電子天平，德國賽多利公司；CF15RX高速離心機(jī)，日本日立公司；HS501振蕩器，德國艾卡公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗

按照NY/T 788—2018《農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[19]分別于我國6處玉米主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行殘留試驗。試驗地的氣候條件及土壤類型見表1。各地的殘留試驗設(shè)2個試驗小區(qū)（1個處理小區(qū)和1個對照小區(qū)），每個小區(qū)面積為100 m2，小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行。于春玉米播種后，出苗前以2 340 g a.i./hm2施用1次78%撲草凈·乙草胺·異 唑草酮懸乳劑，于青玉米成熟期和玉米成熟期分別收獲青玉米、青玉米秸稈和玉米、玉米秸稈。

表1 試驗地氣候條件及土壤類型

1.2.2 樣品采集與制備

于青玉米和玉米成熟期在試驗小區(qū)中按照棋盤式分布采樣，每個小區(qū)采集不少于12株，采集的樣品總量不少于2 kg，并將采集完的樣品裝入樣本容器。處理小區(qū)分別采集2個獨立樣品，對照小區(qū)采集1個樣品。地頭或邊緣0.5 m內(nèi)不采樣。

將采集的青玉米秸稈和玉米秸稈樣品剪切成1 cm以下的小段，充分混勻，用四分法縮分樣品，分取2份200 g樣品，于低溫（-18℃）保存。青玉米和玉米樣品脫粒后以四分法縮分，分取2份200 g樣品，于低溫（-18℃）保存。試驗前用磨粉機(jī)將青玉米、青玉米秸稈、玉米和玉米秸稈樣品制成粉末狀樣品。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取撲草凈、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg至10 mL燒杯中，加乙腈溶解并用10 mL容量瓶定容，配制成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg至10 mL燒杯中，加丙酮溶解，并用10 mL容量瓶定容，配制成濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將上述濃度為1000 mg/L撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋配得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，隨后再用乙腈逐級稀釋配制成0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃保存，待用。

1.2.4 樣品前處理

分別稱取10.0 g青玉米、10.0 g玉米、5.0 g青玉米秸稈和5.0 g玉米秸稈于50 mL離心管中，依次加入適合比例的乙腈提取劑，振蕩30 min，隨后加入5 g NaCl，渦旋10 min，以3 500 r/min離心5 min，待凈化。

取1 mL上層乙腈相轉(zhuǎn)移至含有吸附劑的離心管中，渦旋30 s，以10 000 r/min離心3 min，取上清液，經(jīng)0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，待測。

1.2.5 儀器條件

色譜條件。利用配備超高效液相色譜（I-Class，Waters）的三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）對撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈進(jìn)行分析。Acquity UPLC BEH T3（100 mm×2.1 mm，1.8μm）用于液相色譜分離，柱溫為35℃，進(jìn)樣體積為5μL，流速為0.3 mL/min。流動相由5 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B）的混合溶劑組成。采用梯度洗脫，洗脫程序：0～1 min，10%B；1～2.0 min，10%～90%B；2.0～3.0 min，90%B；3.0～3.5 min，90%～10%B；3.5～5.0 min，10%B。

質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；撲草凈和乙草胺的掃描方式：正離子掃描，異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的掃描方式：負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：450℃；脫溶劑氣流量：1000L/h；錐孔氣流量：150L/h；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），詳見表2。

表2 撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.6 除草劑檢測方法優(yōu)化

優(yōu)化提取溶劑。用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈，使上述4種基質(zhì)中除草劑及代謝物的含量均為0.1 mg/kg；分別對撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的提取溶劑純乙腈、乙腈∶水（20∶20，V/V）、乙腈∶水（20∶10，V/V）進(jìn)行優(yōu)化篩選。

優(yōu)化凈化條件。取上層乙腈提取液1 mL，加入至25～100 mg常用的吸附劑PSA、GCB和C18中，評估其使用量并選用最適材料。

1.2.7 定量限和檢測限

以3倍的信噪比（S/N）來確定目標(biāo)化合物的檢測限（LOD），以最小添加回收濃度作為方法的定量限（LOQ）。為了確定青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈中的撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的LOQ值，用工作溶液0.01 mg/L加標(biāo)4種樣品，按照上述方法進(jìn)行提取和凈化，逐級稀釋直至目標(biāo)化合物的S/N比為10（S/N=10）。

1.2.8 添加回收測定

將混有撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加3組濃度到空白玉米、青玉米、玉米秸稈和青玉米秸稈樣品中，每檔濃度重復(fù)5次，用上述分析方法測定并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的國家估算每日攝入量（NEDI）和風(fēng)險商（RQ）按式（1）、（2）計算[20]。

式中：STMRi為農(nóng)藥在某種食品中的規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；Fi為一般人群對該食品的消費量，kg；bw為中國人均體重，kg（一般以63 kg計）；ADI為農(nóng)藥的每日允許攝入量mg/(kg bw)。

當(dāng)RQ≤100%時，表示其風(fēng)險可以接受，RQ值越小，風(fēng)險越??；當(dāng)RQ＞100%時，表示有不可接受的慢性風(fēng)險，RQ值越大，風(fēng)險越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取與凈化

2.1.1 提取劑的選擇

提取劑的選擇如圖1所示，使用純乙腈對撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈在青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈中的平均提取率在50.9%～72.6%，乙腈∶水（20∶20，V/V）的平均提取率在74.3%～83.2%，乙腈∶水（20∶10，V/V）對上述4種化合物的平均提取率在92.3%～102.2%。因此，乙腈∶水（20∶10，V/V）是提取青玉米、玉米、青玉米秸稈和玉米秸稈中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的最佳溶劑。

圖1 撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的提取率

2.1.2 凈化劑的選擇

根據(jù)優(yōu)化試驗結(jié)果，使用30 mL乙腈∶水（20∶10，V/V）提取目標(biāo)化合物。如表3所示，每1 mL提取物中的C18含量在25～100 mg時，撲草凈、乙草胺、異唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的平均回收率低于86.7%；每1 mL提取物中的PSA含量在25～75 mg時，平均回收率介于84.2%～103.2%，可能因PSA凈化劑含有2個氨基，可與提取液中有機(jī)酸、脂肪酸、色素、糖類等極性基質(zhì)成分結(jié)合，且對目標(biāo)農(nóng)藥和代謝物不具有吸附效果，當(dāng)PSA使用量超過50 mg時，4種化合物的平均回收率均下降；每1 mL提取物中的GCB含量在25～100 mg時，平均回收率在41.2%～87.1%，隨著GCB使用量的增加，其回收率逐漸減小，說明GCB與目標(biāo)化合物之間具有強(qiáng)吸附性。

表3 不同凈化劑對4種化合物的凈化效果對比

考慮到樣品回收率和凈化的成本，故本次試驗使用50 mg PSA凈化青玉米、玉米中的雜質(zhì)。對于秸稈樣品，本次試驗使用25 g GCB進(jìn)行凈化，原因在于其有著特殊的層狀結(jié)構(gòu)，能夠吸附秸稈提取液中的色素和甾醇類物質(zhì)，且25 mg GCB不會吸附目標(biāo)化合物。

2.2 方法驗證

如表4所示，在0.001～0.5 mg/L范圍內(nèi)，撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.999。

在上述條件下，撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的檢測限（LOD）分別為1.1×10-5、1.1×10-5、4.8×10-6、1.1×10-5ng（表4）。以最小添加回收濃度作為方法的定量限，在上述色譜條件下?lián)洳輧?、乙草胺、?唑草酮和異 唑草酮-二酮腈在玉米中的定量限（LOQ）分別為0.01、0.005、0.005和0.005 mg/kg；在青玉米中的最低檢出濃度均為0.005 mg/kg，在玉米秸稈中的最低檢出濃度均為0.02 mg/kg，在青玉米秸稈中的最低檢出濃度分別為0.02、0.02、0.02和0.01 mg/kg（表5）。

表4 撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的標(biāo)準(zhǔn)曲線和LOD

表5 撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的添加回收試驗結(jié)果（n=5）

玉米中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的平均回收率為75.5%～108.4%，RSD值為2.9%～12.7%；青玉米中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的平均回收率為82.6%～105.3%，RSD值為1.7%～13.6%；玉米秸稈中上述除草劑及代謝物的平均回收率為86.7%～110.8%，RSD值為1.9%～14.0%；青玉米秸稈中除草劑及代謝物的平均回收率為86.9%～107.8%，RSD值為0.8%～14.4%。結(jié)果表明，該方法的精密度、重現(xiàn)性和靈敏度足以滿足同時定量測定玉米、青玉米、玉米秸稈和青玉米秸稈中除草劑及代謝物的殘留量。

2.3 玉米中撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的最終殘留量及膳食暴露風(fēng)險評估

如表6所示，玉米、青玉米、玉米秸稈和青玉米秸稈中撲草凈的殘留量均未檢出，低于GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[21]規(guī)定的玉米中撲草凈最大殘留限量（MRL）（0.02 mg/kg）；乙草胺在上述4種基質(zhì)中也均未檢出，低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的MRL（0.05 mg/kg）；異 唑草酮和異 唑草酮代謝物在上種4種基質(zhì)中也均未檢出。

表6 玉米、青玉米、玉米秸稈、青玉米秸稈中撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的最終殘留量

為了準(zhǔn)確評估NEDI，應(yīng)考慮中國的飲食攝入方式以及在中國注冊并使用撲草凈、乙草胺、異 唑草酮的農(nóng)作物及其在各國的相應(yīng)最大殘留限量。表7列出了我國國民對部分食物的膳食量（Fi）。按照中國、CAC、美國、歐盟、澳大利亞、韓國、日本的順序選擇最大殘留量（MRL）[22]。此外，在計算相應(yīng)的NEDI時，僅選擇確保給定食品中NEDI最高的參考?xì)埩粝蘖?。根?jù)不同食品的殘留數(shù)據(jù)得出撲草凈的總NEDI為0.048 2 mg/(kg bw)，RQ為1.91%；乙草胺的總NEDI為0.023 0 mg/(kg bw)，RQ為3.65%；異唑草酮的總NEDI為0.000 437 mg/(kg bw)，RQ為0.035%。

表7 玉米中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮的膳食風(fēng)險評估結(jié)果

3 結(jié) 論

本文結(jié)合了改良的QuEChERS方法和UPLCMS/MS檢測技術(shù)，同時定量測定玉米、青玉米、玉米秸稈和青玉米秸稈中撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的殘留量。該方法檢測的基質(zhì)更為廣泛，涵蓋了春玉米生長的全過程，且具有回收率高，準(zhǔn)確性高和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點。所提出的方法適用于監(jiān)測田間和市場上的玉米、青玉米、玉米秸稈和青玉米秸稈中的撲草凈、乙草胺、異 唑草酮和異 唑草酮-二酮腈的殘留量。在田間條件下，施用復(fù)配藥劑78%撲草凈·乙草胺·異 唑草酮SE后，玉米、青玉米、玉米秸稈和青玉米秸稈中撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的最終殘留量均未檢出，低于其相應(yīng)規(guī)定。玉米中撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的膳食風(fēng)險評估結(jié)果顯示，成熟期收獲的玉米RQ值均低于100%。這些數(shù)據(jù)表明，玉米播種后，出苗前以2 340 g a.i./hm278%撲草凈·乙草胺·異 唑草酮SE對土壤噴施1次，不會對健康造成潛在的危害。本研究為在玉米上合理使用撲草凈、乙草胺和異 唑草酮的復(fù)配農(nóng)藥提供了數(shù)據(jù)支撐，并為玉米食用安全性的初步評估提供參考。