梅佳慧 婁煥堃 王勛 韓翠敏 李鵬 邢團(tuán)結(jié) 汪明瑯 王怡練

蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，連云港 222006

不對(duì)稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是有效的內(nèi)源性一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS，減少一氧化氮（nitric oxide，NO）產(chǎn)生。ADMA 在慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）血液透析患者的血漿中可持續(xù)升高［1］，其在尿毒癥患者動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）過程中起著重要作用［2］。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）作為另一種與AS 有關(guān)的多功能蛋白，在膽固醇和三酰甘油的代謝中扮演著重要角色，其與肝臟受體的結(jié)合有助于介導(dǎo)血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白的清除［3］。ApoE基因多態(tài)性也被認(rèn)為與心血管疾病（cardiac vascular diseases，CVD）有關(guān)，Boerwinkle 等［4］報(bào)道在血漿總膽固醇中高達(dá)17%的遺傳變異性都可能歸因于ApoE 基因多態(tài)性。鑒于ApoE 基因多態(tài)性與低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量和冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性［5］，ApoE 基因多態(tài)性可能會(huì)引起CKD 患者對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙和AS 的易感性。本研究的目的是評(píng)價(jià)ADMA 水平與ApoE 基因多態(tài)性在基于腎功能程度分組患者中的相互作用。

資料與方法

1、一般資料

選擇2018年1月至2020年1月在連云港市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科、腎內(nèi)科住院的CKD 患者300 例。根據(jù)慢性腎臟疾病流行病學(xué)協(xié)作（chronic kidney disease epidemiology collaboration，CKD-EPI）公式估算的腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）被分為3 組進(jìn)行對(duì)照研究：Ⅰ組GFR ＞60 ml/min，包括腎功能正常患者（86 例），Ⅱ組15 ml/min ＜GFR ≤60 ml/min（119 例），Ⅲ組 GFR ≤15 ml/min或正接受血液透析（95 例）。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18 歲、臨床或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)懷疑急性腎衰竭、腎病綜合征、妊娠、惡性腫瘤等。

本研究經(jīng)連云港市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017K029）；所有患者均得到研究相關(guān)的詳細(xì)解釋，并簽署知情同意書。

2、臨床病例資料收集

以臨床評(píng)價(jià)、全身檢查、檔案審閱及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)收集患者資料?；举Y料：年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、腰圍、糖尿病史、心血管疾病史（腦血管疾病、冠心病、周圍血管病、充血性心力衰竭等）、他汀是否使用、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、肌酐、C反應(yīng)蛋白等。

3、DNA提取

常規(guī)抽取研究對(duì)象外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸鹽（EDTA）抗凝，采用QIAGEN（德國(guó)）提供的QIAamp DNA Mini Kit（51304）提取 DNA，并結(jié)合 Thermo 公司（美國(guó)）NanoDrop 2000 分光光度計(jì)，檢測(cè)所提取DNA 的純度和濃度。

4、ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)

應(yīng)用軟件Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)ApoE 基因檢測(cè)位點(diǎn)所在基因片段的擴(kuò)增引物。先使用Q5 高保真熱啟動(dòng)聚合酶（NEB）PCR 法擴(kuò)增基因片段，再采用熒光標(biāo)記單堿基延伸技術(shù)（SNaPshot?Multiplex Kit，ABI）結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行微測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果采用GENEMAPPERID V5.0 軟件進(jìn)行分析，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP 位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色確定該SNP位點(diǎn)的基因型。

5、ADMA水平測(cè)定

患者入院后禁食12 h，清晨、空腹、安靜平臥10 min，肘靜脈采血3 ml，肝素抗凝，2 500 r/min 離心20 min，離心半徑10 cm，分離上層血清，-80 ℃冰箱凍存，以酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）檢測(cè)ADMA水平。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。本研究檢驗(yàn)水準(zhǔn)均采用α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、資料特征

300 例患者年齡（61.9±13.1）歲，男性151 例（50.33%），BMI（28.0±5.1）kg/m2，糖尿病 88 例（29.33%），心血管疾病174 例（58.00%）；3 組間糖尿病、冠心病比例及低密度脂蛋白、三酰甘油、肌酐、ADMA 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 慢性腎臟病患者資料特征

2、ApoE基因多態(tài)性在不同腎功能組的分布

ε2等位基因在35例（11.67%）患者中存在，ε3等位基因在287 例（95.67%）中存在，ε4 等位基因在58 例（19.33%）中存在。ε3/2基因型出現(xiàn)在29例（9.67%）患者中，ε3/3基因型213例（71.00%），ε4/2基因型6例（2.00%），ε4/3基因型45例（15.00%），ε4/4基因型7例（2.33%）。ApoE等位基因在不同腎功能分組中分布是均一的（均P＞0.05）。見表2。

表2 慢性腎臟病患者ApoE基因多態(tài)性在不同腎功能的分布（例）

3、基于是否腎臟替代治療和存在ε4 等位基因的患者資料特征

接受腎臟替代治療的患者存在ApoE ε4 等位基因比不存在ApoE ε4 等位基因的血漿ADMA 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 基于腎臟替代治療及ε4等位基因分組的慢性腎臟病患者資料特征

4、根據(jù)ADMA水平分組的CKD患者資料特征

隨著ADMA 水平的升高，患者的尿酸、肌酐水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 根據(jù)ADMA水平分組的慢性腎臟病患者資料特征

5、ApoE基因多態(tài)性在不同ADMA水平的分布

ApoE 等位基因在不同ADMA 水平的分布中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表5。

表5 慢性腎臟病患者ApoE基因多態(tài)性在不同ADMA水平的分布（例）

6、腎臟替代治療患者中ε4 等位基因頻率與ADMA 水平3級(jí)的相關(guān)性分析

通過logistic 回歸分析，在控制混雜因素及擬合各變量之間相互影響的條件下，得到了ε4 等位基因與ADMA 3 級(jí)水平的相關(guān)性分析（OR=0.042，95%CI：0.007～0.254，P＜0.001），見表6。

表6 95例慢性腎臟病腎臟替代治療患者中ε4等位基因頻率與ADMA水平3級(jí)的相關(guān)性分析

討 論

內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的早期階段。ADMA 作為CVD 的生物標(biāo)志物，是NOS 的主要內(nèi)源性抑制劑，參與了CKD 中AS 的發(fā)生。ApoE 基因多態(tài)性與AS的相關(guān)性，可能增加CKD患者AS的易感性。

本研究結(jié)果表明，血漿ADMA 水平升高與GFR 降低相關(guān)，ApoE 等位基因在不同腎功能分組中分布是均一的，在不同ADMA 水平分組中分布是不均一的。接受腎臟替代治療的患者存在 ApoE ε4 等位基因比不存在ApoE ε4 等位基因的血漿ADMA 水平明顯降低，而這種差異在腎功能正常或早期CKD患者中并沒有發(fā)現(xiàn)。

在本研究中，3 組患者的血漿ADMA 水平隨著CKD 的發(fā)展而逐漸升高，ADMA 水平與腎功能有著內(nèi)在的聯(lián)系［6］，是腎臟病進(jìn)展至終末期（end stage renal disease，ESRD）和病死率的一個(gè)強(qiáng)有力的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素［7］。ADMA 在一定程度上是經(jīng)腎臟排泄，其在CKD 中的升高與蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的增加也有關(guān)，這是參與翻譯后精氨酸殘基甲基化過程的酶家族，也是蛋白質(zhì)修飾的一種常見機(jī)制。此外，CKD患者ADMA的積累也與二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）活性降低有關(guān)，它是ADMA 降解的主要途徑之一，將ADMA 水解為二甲胺和L-瓜氨酸［8］。據(jù)估計(jì)，人類健康每天生產(chǎn)大約300 μmol ADMA，其中大約250 μmol由DDAHs代謝［9］。

ADMA 是一種內(nèi)源性NOS 抑制劑，這可能部分解釋了CKD 患者和CKD 動(dòng)物模型血管舒張功能受損、炎癥升高和血管生成減少現(xiàn)象［10］。ADMA的積累是CKD患者發(fā)生內(nèi)皮功能障礙和CVD的危險(xiǎn)因素之一［11］。

ApoE常見的遺傳性等位基因包括ε2、ε3、ε4三種，其中ε3 是人群中最常見的一種亞型，被稱為野生型［12］，ε2、ε4 在人群中少見，被認(rèn)為是變異型，共有6種基因型，分別是ε2/ε 2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4［13］，與 ε2/ε4、ε3/ε3 相比，ε3/ε4、ε4/ε4攜帶者膽固醇、LDL-C最高，ε2/ε3型攜帶者膽固醇、LDL-C水平最低。同時(shí)ε3/ε4、ε4/ε4攜帶者HDL-C低于 ε2/ε3［14-15］。與 ε3/ε3 基因型的個(gè)體相比，ε2 攜帶者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)低20%，ε4 攜帶者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)稍高［16］。ApoE 具有調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌及抵抗氧化應(yīng)激的作用，其中ApoEε4 等位基因缺乏ApoEε2 和 ApoEε3 抗炎特性，而具有較強(qiáng)的促炎作用，能激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），并釋放較高的促炎分子及較低的抗炎分子［17］。

腎功能異常和ApoE 基因多態(tài)性之間的聯(lián)系也有相關(guān)研究［18］，ε2等位基因是CKD 的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，并與ESRD 風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［19-20］，ε4 等位基因可能與較低的糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［12］；Roussos 等［21］發(fā)現(xiàn) ESRD 病患者的 ε2、ε3 和 ε4 分布沒有差異。在我們的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)基于腎功能分組，等位基因和基因型分布之間的顯著差異。

當(dāng)評(píng)估腎臟替代治療患者中ADMA 水平和ApoE 等位基因頻率之間的關(guān)系時(shí)，我們觀察到腎臟替代治療組ADMA水平最高的患者顯示出的ε4等位基因頻率明顯低于ADMA 水平低的患者，即使在校正混雜因素后，這種關(guān)聯(lián)仍然顯著。這種聯(lián)系表明尿毒癥能夠在ε4 等位基因攜帶者中伴有較低的血漿ADMA 水平，ApoEε4 等位基因的表達(dá)可能受到腎功能異常等臨床變量的限制，正如我們?cè)谘芯恐兴吹降模錂C(jī)制有待于進(jìn)一步研究確定。

本研究結(jié)果表明，尿毒癥能降低ε4 等位基因攜帶者的血漿ADMA 水平。在腎臟替代治療患者中，ApoEε4 等位基因頻率較低和ADMA 水平較高之間的這種聯(lián)系可能表明了一種在尿毒癥炎癥狀態(tài)下探討AS 形成的新方法，此類觀察結(jié)果的確認(rèn)需要在更大人群研究的縱向觀察中進(jìn)行驗(yàn)證。

我們的研究也存在一定的局限性，這是一項(xiàng)單中心描述性橫斷面研究，另外遺傳分析方法（單核苷酸多態(tài)性）在理解基因型-表型界面方面有局限性，這些方法不能同時(shí)分析多個(gè)基因，阻礙了對(duì)多基因疾病遺傳特征的研究。

在以后的研究中我們擬入選更多的CKD患者來驗(yàn)證較低頻率的ApoE ε4 等位基因與較高水平的ADMA 之間的聯(lián)系是否也發(fā)生在CKD的早期階段。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突