寧凡盛，路巖翔，曹桂云，孟兆青，閆慧嬌，王岱杰

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)a.山東省分析測試中心; b.藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.濟(jì)南市行政審批服務(wù)局，山東 濟(jì)南 250001；3.山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 濟(jì)南 250000)

銀杏葉由銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的葉子干燥而成[1]，是目前中藥常用品種，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂的功效[2-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，銀杏葉提取物能夠抗氧化、抗衰老、降血壓、促進(jìn)血液循環(huán)、提高腦部功能[6-8]。銀杏內(nèi)酯C是銀杏葉中主要的活性成分，是控制藥材質(zhì)量和成藥標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)[9-11]。銀杏內(nèi)酯是一類具有特殊分子結(jié)構(gòu)的二萜內(nèi)酯類化合物，銀杏葉制劑的療效和內(nèi)在質(zhì)量是由銀杏內(nèi)酯的含量決定的[12]。目前國內(nèi)市場上的銀杏內(nèi)酯C以對照品為主，純度在85%～98%，級別參差不齊，未按照國標(biāo)的要求對其進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品評測，樣品不具有溯源性[13-16]。為滿足銀杏、銀杏葉及其他含有銀杏內(nèi)酯C藥材的成分分析、樣品檢測、質(zhì)量控制等需求，保證結(jié)果的可比性、準(zhǔn)確性和溯源性[17]，急需對銀杏內(nèi)酯C進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備研究。

GB/T 15000.2—2019《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第2部分：常用術(shù)語及定義》[18]中關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)樣品的定義是：足夠均勻的一種或多種，具有化學(xué)的、物理的、生物學(xué)的、工程技術(shù)的或感官的等性能特征，經(jīng)技術(shù)鑒定，附有說明相關(guān)性能數(shù)據(jù)證書的樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品可以對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，對相關(guān)測量方法進(jìn)行評價和對材料賦值[19-22]。天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品是天然產(chǎn)物質(zhì)控方面確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量不可或缺的參照物，具有高度均勻性和良好的穩(wěn)定性。但我國目前已研發(fā)出的天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品，無論在種類還是在數(shù)量上均嚴(yán)重不足，直接給相關(guān)產(chǎn)品的檢驗和檢測帶來困擾，同時還制約了相關(guān)檢測和質(zhì)控行業(yè)的發(fā)展[23]。本文為解決銀杏內(nèi)酯C標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的問題，參照GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品 定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[24]，成功研制出滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的銀杏內(nèi)酯C樣品，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 銀杏內(nèi)酯C的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

DZKW-C恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-3(瑞士Buchi公司)配有V-700真空泵(瑞士Buchi公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Shimadzu LC-6AD高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；Agilent 1220高效液相色譜儀(美國Agilent科技公司)；島津TG-40 DTA-40M 熱重分析儀(日本Shimadzu公司)；Elementar全自動元素分析儀vario EL III(德國Elementar公司)；SP-20E型全自動點樣儀(上?？普苌萍加邢薰?；WRS-1B數(shù)字熔點儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；UV-2700紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；Agilent 6520 Q-TOF四極桿聯(lián)用飛行時間質(zhì)譜(美國Agilent科技公司)；INOVA 400 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)。

1.2 實驗材料

無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，瑞典Oceanpak試劑公司)；實驗用水為超純水；柱層層析硅膠(100～200目)(青島鼎康硅膠有限公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(Amersham Biosciences公司)；G254薄層硅膠板(青島海洋化工廠)。

實驗所用銀杏葉均購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，由山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 樣品的提取

2.1.2 樣品的純化

制得的銀杏內(nèi)酯C經(jīng)冷凍干燥得到白色粉末，用4 mL棕色瓶進(jìn)行分裝，每瓶10 mg(十萬分之一天平稱量)，分裝好的樣品瓶放在4 ℃冰箱中長期保存。

2.2 純度分析方法

2.2.1 高效液相色譜分析

將制備得到的高純度銀杏內(nèi)酯C溶于甲醇，配制質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的溶液，使用配有蒸發(fā)光檢測器的高效液相色譜儀(HPLC-ELSD)檢測，柱溫設(shè)置25 ℃，進(jìn)樣15 μL，流速為1.0 mL/min。ELSD檢測條件：漂移管溫度105 ℃，氣體流速3.5 L/min，增益值為1。等度色譜條件：色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，0～30 min，32%A；運(yùn)行時間30 min。梯度色譜條件：色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)；梯度：0～30 min，10%～100%A，30～35 min，100%A。

等度色譜分析結(jié)果顯示扣除溶劑峰后，樣品純度高于98%；梯度色譜分析結(jié)果顯示30～35 min未有明顯雜質(zhì)峰出現(xiàn)，證明樣品是單一的、純度高于98%的銀杏內(nèi)酯C。色譜分析結(jié)果見圖2。

圖2 銀杏內(nèi)酯C HPLC圖譜

2.2.2 薄層鑒別

點樣結(jié)果表明，樣品在兩個展開體系中均呈現(xiàn)單一棕黃色斑點，Rf值分別為0.50(展開劑I)和0.31(展開劑II)，樣品向上延展的路徑中沒有明顯雜質(zhì)斑點出現(xiàn)。薄層色譜圖見圖3。

圖3 薄層色譜圖

2.2.3 液質(zhì)聯(lián)用純度分析

色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；流動相乙腈(A)-水(B)；梯度洗脫條件0～30 min，10%～100%A；運(yùn)行時間30 min。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，掃描范圍為m/z=100～1000，載氣為高純度氮氣，氣體流速為10 L/min，載氣溫度設(shè)置300 ℃，毛細(xì)管電壓為4.0 kV。

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析結(jié)果表明，正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖均未見明顯雜質(zhì)峰存在?？傠x子流圖見圖4。

圖4 銀杏內(nèi)酯C總離子流圖

2.2.4 熱重分析

精密稱定銀杏內(nèi)酯C樣品5.0 mg于熱重分析(TG)用坩堝中，熱重條件初始溫度30.0 ℃，最終溫度600.0 ℃，升溫速率10 ℃/min，流量100 mL/min，氣體為氮氣。

分析結(jié)果表明，在溫度28.1～298.5 ℃范圍內(nèi)，樣品的熱重曲線是一條直線(無明顯變化)，說明銀杏內(nèi)酯C中基本不含有吸附水和易揮發(fā)性物質(zhì)，熱穩(wěn)定性良好。當(dāng)溫度上升至353.4 ℃時，樣品開始分解。TG曲線見圖5。

圖5 銀杏內(nèi)酯C的TG曲線

2.3 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

銀杏內(nèi)酯C的結(jié)構(gòu)確認(rèn)采用4種常見光譜技術(shù)(紫外、紅外、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù))。紫外分析法(UV)以甲醇為測試溶劑，掃描范圍為190～640 nm。紅外分析法(IR)使用KBr壓片液膜，掃描范圍為400～6 000 cm-1，采樣速率為80張/s。質(zhì)譜分析法(MS)使用高分辨質(zhì)譜，離子源為ESI離子源，載氣為普通氮氣，錐孔氮氣流速10 L/min，載氣溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4.0 kV，掃描范圍m/z=100～1 500。核磁共振分析法(NMR)氘代溶劑為DMSO，采集1H譜和13C譜。

圖6 銀杏內(nèi)酯C的UV譜圖

圖8 銀杏內(nèi)酯C質(zhì)譜圖

表1 銀杏內(nèi)酯C的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

以上各項光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報道的銀杏內(nèi)酯C基本一致，化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果為銀杏內(nèi)酯C。

2.4 均勻性檢驗

按照工作導(dǎo)則中均勻性檢驗的要求，采用隨機(jī)抽取、重復(fù)測量的方法，從分裝好的樣品中隨機(jī)抽取10瓶，按照3種抽取方式(第一次抽樣為1、3、5、7、9、2、4、6、8、10號瓶；第二次抽樣為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1號瓶；第三次抽樣為2、4、6、8、10、1、3、5、7、9號瓶)，然后從每瓶中精密稱定1.5 mg樣品3份，用色譜甲醇溶解定容至1 mL容量瓶備用，按照2.2.1項下等度色譜條件對每個樣品進(jìn)行測定，以樣品峰面積的百分比讀取樣品純度，數(shù)據(jù)進(jìn)行均勻性檢驗和方差分析，計算出F值，以確定銀杏內(nèi)酯C的均勻性是否良好，檢驗結(jié)果見表2～3。

表2 均勻性檢驗數(shù)據(jù)

表3 方差分析數(shù)據(jù)

(1)

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差計算：

(2)

u均=Sbb=0.008。

(3)

F值計算：

F=SM間/SM內(nèi)=2.04。

(4)

以υ1(即組間)=9及υ2(即組內(nèi))=20，查詢F界值表，得F0.05(9, 20)=2.94，由于F=2.04<2.94，說明銀杏內(nèi)酯C的均勻性良好。

2.5 穩(wěn)定性檢驗

將銀杏內(nèi)酯C儲存在0～4 ℃，考察樣品2年的穩(wěn)定性。分5個時間段考察，按2.2.1項下等度條件進(jìn)行分析，使用峰面積百分比對樣品純度進(jìn)行計算。每個樣品復(fù)測5次，采用t檢驗法對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算穩(wěn)定性的不確定度[26]，分析結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性檢驗試驗結(jié)果

斜率計算：

(5)

截距計算：

(6)

直線模型的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(7)

將s=0.017代入公式，斜率相關(guān)的不確定度：

(8)

u穩(wěn)=s(b1)×t=0.001×24=0.024。

(9)

查表得，自由度為(n-2)和95%置信水平(p=0.95)的t0.95,n-2=3.182，由于|b1|

上述計算結(jié)果說明，銀杏內(nèi)酯C樣品在2年內(nèi)的長期穩(wěn)定性好。

2.6 定值分析

按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則GB/T 15000.3—2008的要求，選取8個實驗室進(jìn)行定值實驗，隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個實驗室分配3瓶，每瓶樣品進(jìn)行2次平行測定。采用高效液相色譜法測定樣品純度，利用各實驗室的純度數(shù)據(jù)計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行定值實驗。銀杏內(nèi)酯C純度定值結(jié)果匯總?cè)绫?所示。

表5 協(xié)作定值數(shù)據(jù)匯總

測定結(jié)果總平均值的計算：

(10)

各實驗室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(11)

總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(12)

多家定值的不確定度：

(13)

標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度由以下3部分組成：(1)均勻性檢驗的不確定度(u均=0.008%)，(2)穩(wěn)定性檢驗的不確定度(u穩(wěn)=0.024%)，(3)多家定值的不確定度(u定=0.014%)。需通過這3部分不確定度合成計算得到合成不確定度(u合成)，

u合成=0.03%。

當(dāng)置信區(qū)間95%時，k=2，擴(kuò)展不確定度uCRM=2u合成=0.06%。

3 結(jié)論

本研究嚴(yán)格按照GB/T 15000.3—2008的要求，對銀杏內(nèi)酯C進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)品建立所需要的實驗,即均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗和定值分析，根據(jù)這三個方面進(jìn)行了不確定度的合成和擴(kuò)展，獲得了定值純度為(99.85±0.06)%的銀杏內(nèi)酯C國家標(biāo)準(zhǔn)樣品。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于銀杏內(nèi)酯C的含量測定、純度檢測與質(zhì)量控制，為銀杏、銀杏葉及其他含有銀杏內(nèi)酯C藥材的成分分析、樣品檢測、科學(xué)研究和產(chǎn)品開發(fā)提供了技術(shù)支撐和溯源保證。本實驗為天然產(chǎn)物研制成國家標(biāo)準(zhǔn)樣品起到了補(bǔ)充效果，填補(bǔ)了銀杏內(nèi)酯C標(biāo)準(zhǔn)樣品在國內(nèi)外的空白。