周青帥 趙行行 李冬梅 崔古貞 陳崢宏 任瑋 齊曉嵐 洪偉

貴州醫(yī)科大學1地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室&貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室，2貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室，3免疫學教研室（貴陽550004）

大腸埃希菌是世界范圍內(nèi)造成炎癥性腸病高發(fā)病率的重要病原體，炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種容易復發(fā)的慢性炎癥性疾病，在IBD 相關的腸道黏膜活檢和糞便標本中可分離出大量致病性大腸埃希菌［1-2］。病原微生物進入血液可引發(fā)血流感染（blood strean infection，BSI），BSI中兒童患者高比例檢測出大腸埃希菌，在相關報道中對頭孢曲松耐藥率達到了32.65%，對頭孢他啶耐藥率為8.33%［3］。此外，植入手術后的大腸埃希菌感染成為了常見的醫(yī)院內(nèi)感染，由于大腸埃希菌容易在植入材料上形成生物膜，使得此類感染難以治療［4-5］。部分外科手術中大腸埃希菌成為主要的感染源，且相應出現(xiàn)高耐藥率［6］。

群體感應系統(tǒng)（quorum sensing system，QS）在誘導物作用下調(diào)節(jié)種群數(shù)量和基因表達，使其更好的適應生存環(huán)境［7］。QS 在誘導信號分子產(chǎn)生、釋放達到一定的閾值后，細菌受體蛋白感知信號后調(diào)節(jié)自身基因的表達，改變細菌的表型，包括細菌的毒力、生物膜的形成、運動能力的改變，以及對藥物的抗性等［8-10］。大腸埃希菌密度調(diào)節(jié)子C（quorum sensingE.coliregulator C，qseC）是典型的革蘭陰性菌中的QS，屬于大腸埃希菌qseBC 雙組分系統(tǒng)，qseC 基因大小約為1.3 kb，編碼組氨酸蛋白激酶，是該雙組分系統(tǒng)中負責感應識別外部信號分子的受體部分［11-12］，有研究人員發(fā)現(xiàn)qseC的缺失會干擾qseB的去磷酸化，從而釋放出一個不受控制的正反饋回路，下調(diào)毒力基因的表達［13］。在體外，使用qseC抑制劑能阻斷qseBC 的信號傳遞，使用抑制劑LED209 能降低腸出血性大腸埃希菌的毒力［14］。qseC基因在大腸埃希菌毒力扮演著重要的地位，但qseC基因?qū)Υ竽c埃希菌其他表型影響尚未清楚。

二型內(nèi)含子（Group ⅡIntron）是由核酶活性的RNA 和IEP 蛋白（Intron encoded protein）組成，是可以在基因組中移動的核糖核蛋白復合物（RNPs），被開發(fā)為基因靶向失活工具［15-16］。課題組利用嗜熱聚球藻（Thermosynechococcus elongatus）中的TeI3c∕4c 二型內(nèi)含子，開發(fā)了受溫度誘導的基因打靶系統(tǒng)（Thermotargetron 系統(tǒng)）［17］，可在42℃～48℃工作，高效失活靶基因。本研究首先利用Thmotargetron系統(tǒng)，靶向失活大腸埃希菌HMS174 菌株qseC基因，構(gòu)建其突變株。接下來，測定ΔqesC突變株的生長速率、溶血、生物膜形成、運動能力的變化，以及對酸堿和抗生素抗性等表型變化，加深對qseC基因功能的認識。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 大腸埃希菌HMS174 和NEBExpres 感受態(tài)細胞均在LB 培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)，LB 液體培養(yǎng)基配制：酵母提取物（Yeast extract）0.5%，胰蛋白胨（Tryptone）1%，氯化鈉（NaCl）1%，固體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉（Agar Powder）。用濃度10 μg∕mL的氯霉素篩選大腸埃希菌轉(zhuǎn)化子。

1.2 主要試劑 高保真DNA 聚合酶和1 kb plus DNA Maker 購自諾唯贊生物科技股份有限公司（Vazyme Biotech，南京），限制性內(nèi)切酶SpeⅠ-HF和BsiWⅠ-HF 購自New England Biolabs（NEB，北京），PCR 產(chǎn)物回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（TIANGEN，北京）。氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、阿莫西林、甲硝唑、諾氟沙星等抗生素購自北京索萊寶公司（Solarbio，北京）。瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根公司，所有引物由生工生物工程股份有限公司合成（Sangon Biotech，上海）。

1.3 打靶引物設計及質(zhì)粒和菌株 首先獲取目的基因序列，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載大腸埃希菌HMS174 的基因組數(shù)據(jù)，找到打靶的目的基因qseC序列信息。然后根據(jù)嗜熱二型內(nèi)含子TeI3c∕4c Intron識別插入位點的規(guī)律（5′-AAnnnnnnnnnnnnnA-3′，n 為ATGC 任意4 種堿基）［17］，設計四條打靶引物。qseC 基因正義鏈第627 位點符合該規(guī)律。根據(jù)該位點設計4 條打靶引物，分別為qseC627s-IBS12、qseC627s-IBS2s、qseC627s-IBS1a、TeI3c-UNV，詳細的序列信息見表1。本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表2。

表1 本研究所需引物Tab.1 Primers used in this study

表2 本研究所需要的質(zhì)粒和菌株Tab.2 Plasmids and strains used in this study

1.4 Thermotargetron 打靶載體構(gòu)建 以pHKTT1A 載體為模版［17］，qseC627s-IBS12∕TeI3c-UNV 和qseC627s-EBS12∕qseC627s-EBS1a 引物對擴增獲得突變的TeI3c∕4c Ⅱ型內(nèi)含子，該內(nèi)含子中的IBS12，EBS1 和EBS2 識別序列突變?yōu)榭商禺愋宰R別qseC基因627s 位點的序列。膠回收上一輪PCR 產(chǎn)物，以其為模板、qseC627s-IBS12∕qseC627s-EBS1a 為引物進行PCR 反應，使用T5 exonuclease-dependent assembly（TEDA）將打靶片段與雙酶切回收產(chǎn)物連接將兩個打靶片段連接為完整打靶片段qseC627s-Intron。SpeⅠ-BsiWⅠ雙酶切pHK-TT1A 載體，膠回收5887 bp 片段后與qseC27s-Intron 連接獲得qseC-627s 打靶載體pHK-TT1A-qseC627s。

1.5 突變株篩選和計算打靶效率 將打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-qseC627s 轉(zhuǎn)化進入HMS174，涂布于LB氯霉素抗性平板（LB-CHL），長出轉(zhuǎn)化子后將轉(zhuǎn)化子接種至LB-CHL 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌液OD600=0.6時，取1 mL 菌液經(jīng)48℃培養(yǎng)1 h 后吸取10 μL 稀釋100 倍涂布于氯霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜。待長出菌落后使用檢測引物DPqseC-F 和DPqseC-R進行菌落PCR 檢測qseC 基因是否打靶成功（插入失活突變株PCR 條帶比野生性菌株大839 bp）。使用引物為DPjunction-U 和DPjunction-D 將檢測成功的菌株送至上海生工公司進行基因測序。將測序正確的菌株使用陰影平板法進行質(zhì)粒丟失。

1.6 生長速率測定 將50 μL 野生型HMS174 菌液和ΔqseC突變株菌液接種至5 mL LB 培養(yǎng)基中，220 r∕min，37℃震蕩培養(yǎng)。每隔3 h 測定一次野生型和突變株菌液OD600值，連續(xù)測定24 h。此實驗做三次獨立重復，根據(jù)測定的數(shù)值繪制野生型和突變株的生長曲線。

1.7 溶血能力測定 將野生型HMS174和ΔqseC突變株的單菌落接種至5 mL TSB培養(yǎng)基中，220 r∕min，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后12 000 r∕min 離心1 min 收集菌液，用新鮮的TSB 培養(yǎng)基重懸菌液，OD 儀調(diào)整OD600至0.1，然后取5 μL 菌液滴在BTSB 平板上（含有5%（V∕V）脫脂綿羊血），37 ℃正置培養(yǎng)24 h 觀察并測量溶血斑的大小。

1.8 生物膜形成測定 將野生型HMS174和ΔqesC突變株單菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，220 r∕min，37℃培養(yǎng)過夜，取500 μL 菌液稀釋到4.5 mL 新鮮LB中，220 r∕min，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8。取200 μL上一步培養(yǎng)菌液至96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，另外以空白的M9培養(yǎng)基作為對照組。小心吸取96孔板中的培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次，用4%的多聚甲醛固定15 mim，結(jié)晶紫染色10 min，然后用雙蒸水清洗3 次，室溫干燥后加上200 μL 33%的冰醋酸將結(jié)晶紫溶解，用酶標儀測定其OD600值。參照對生物膜判定原則［18］，即空白對照組的平均值加上三倍標準差的值為臨界值（Cut-Off value，DC），D＜DC不黏附，DC＜D＜2DC 為弱黏附，2DC＜D＜3DC 為中等黏附，D＞3DC 為強黏附。

1.9 運動能力測定 參考文獻中的方法［19］，用無菌的牙簽將野生型HMS174 和ΔqesC突變株菌液穿刺至0.4%瓊脂濃度的（W∕V）半固體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌圈的大小并測量其直徑。形成的菌圈越大，表示該菌的運動越強，形成的菌圈越小則表示該菌的運動能力越弱，以此比較野生型菌株和qseC突變株的運動能力。

1.10 pH 敏感性測定 在玻璃試管中加入5 mL無菌的LB 培養(yǎng)基，使用3 mol∕L 的鹽酸（HCl）和氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)pH 值。得到pH 值為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 的LB 培養(yǎng)基，分別將野生型菌株和qseC 突變株接種上述培養(yǎng)基，220 r∕min，37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h，測量OD600值［20］。

1.11 抗生素敏感性測定 使用連續(xù)稀釋法［21］測定野生型菌株和qseC突變株對氯霉素（Chloramphenicol）、氨芐青霉素（Ampicillin）、四環(huán)素（Tetracycline）、阿莫西林（Amoxicillin）、甲硝唑（Metronidazole）、諾氟沙星（Norfloxacin）等抗生素的耐藥性。微量瓊脂稀釋法的步驟為：在96 孔板中加入150 μL 的LB 培養(yǎng)基，然后在第一孔設置抗生素濃度為128 μg∕mL，然后連續(xù)2 倍稀釋10 次至濃度為0.25 μg∕mL，依次得到的抗生素濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg∕mL，每孔接種10 μL野生型菌液或qseC 突變株菌液。野生型菌株和qseC突變株分別設置3 個重復組，同時添加陰性對照組（只有LB 培養(yǎng)基）和陽性對照組（菌液接種至無抗生素的LB 培養(yǎng)基中）。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)12 h 后，使用酶標儀測定OD600值，統(tǒng)計數(shù)據(jù)后使用prism 8.0 作抗生素敏感性圖。

1.12 統(tǒng)計學方法 使用prism 8.0 制作統(tǒng)計學圖表，使用獨立樣本t檢驗方法分析是否具有統(tǒng)計學差異，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 突變株篩選和計算打靶效率 在48 ℃誘導基因打靶后，隨機挑取的23 個菌落，菌落PCR 檢測后計算打靶效率為100%（圖1A，野生型vs.失活突變株=1 350 bpvs.2 189 bp）。ΔqseC627s 測序結(jié)果，與野生型HMS174 基因組中qseC基因進行序列比對后，表明TeI3c∕4c 內(nèi)含子（839 bp）成功插入大腸埃希菌基因組qseC627s 位點，測序結(jié)果表明qseC基因成功失活（圖1B）。

圖1 突變株篩選及打靶位點測序驗證Fig.1 Mutants screening and verification

2.2 大腸埃希菌HMS174 和ΔqseC627s 生物學特性比較

2.2.1 生長速率變化 如圖2 所示，測定了野生型菌株和qseC627s 的生長動力學差異。野生型菌株和ΔqseC627s 在接種3 h 前生長速率差異不大，在3 h 后野生型的生長速度明顯快于ΔqseC627s。ΔqseC627s 在15 h 后生長進入平穩(wěn)期，最大OD600值為3.0，野生型菌株在15 h 后仍然繼續(xù)生長，OD600達到了4.0 以上，表明了qseC基因失活后菌株的生長速度減慢，且菌株生長達到的最大生物量降低。

圖2 野生型HMS174 和ΔqseC627s 生長速率比較eFig.2 Growth rate of wild-type HMS174 and ΔqseC627s strains

2.2.2 溶血能力變化 如圖3所示，在BTSB平板上野生型HMS174 和ΔqseC627s 溶血能力有差異性。圖3A 黃色箭頭所示，野生型大腸埃希菌HMS174產(chǎn)生了一層顏色略淺的溶血圈，而ΔqseC627s 沒有出現(xiàn)顏色略淺的溶血圈（圖3B）。表明大腸埃希菌HMS174qseC基因與其溶血能力相關，當qseC基因失活后其溶血能力消失。

圖3 野生型HMS174 和ΔqseC627s 溶血能力Fig.3 Hemolytic ability of wild-type HMS174 and ΔqseC627s

2.2.3 生物膜形成能力變化 如圖4 所示，野生型HMS174 的生物膜黏附性為強黏附，ΔqseC627s 的生物膜黏附性也為強黏附，但是ΔqseC627s 和野生型HMS174 相比，生物膜形成減少明顯（P＜0.01），表明qseC基因參與了大腸埃希菌生物膜形成過程，對其生物膜的形成具有正向調(diào)節(jié)作用。

圖4 野生型HMS174 和ΔqseC627s 生物膜形成能力Fig.4 Biofilm formation of wild-type HMS174 and ΔqseC627s strain

2.2.4 運動能力變化 37 ℃培養(yǎng)12 h 后，野生型大腸埃希菌HMS174 和ΔqseC627s 突變株在平板形成了圓形菌落圈，通過測量兩者菌落圈的直徑，野生型HMS174 和ΔqseC627 突變株直徑分別為（36.67±1.15）mm 和（11±1.0）mm（圖5A），統(tǒng)計學分析野生型大腸埃希菌HMS174 和ΔqseC627s 突變株菌落大小差異極顯著（P＜0.01）。表明qseC可以影響大腸埃希菌HMS174的運動能力（圖5B）。

圖5 野生型HMS174 和ΔqseC627s 運動能力比較Fig.5 Motility of wild-type HMS174 and ΔqseC627s strain

2.2.5 野生型HMS174 和ΔqseC627s 不同pH 耐受能力變化 野生型HMS174 和ΔqseC627s 在pH 值為5 ～8 之間均能生長（圖6），但是ΔqseC627s 的耐受能力較HMS174 降低顯著（P＜0.01）。

圖6 野生型HMS174 和ΔqseC627s pH 耐受性Fig.6 pH tolerance of HMS174 and ΔqseC627s strain

2.2.6 抗生素耐藥性變化 圖7A-圖7F 依次為HMS174 和ΔqseC627s 對于氯霉素等抗生素的耐受性結(jié)果。ΔqseC627s 較野生型對氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、阿莫西林、甲硝唑等抗生素耐受性降低，對諾氟沙星敏感性無明顯變化。

圖7 野生型HMS174 和ΔqseC627s 對6 種抗生素的耐受性測定Fig.7 Resistance of HMS174 and ΔqseC627s to 6 antibiotics

3 討論

大腸埃希菌感染已成為常見的病原微生物感染類型，在腹瀉患者中檢測到大量的腹瀉性大腸埃希菌，該菌已成為主要的腹瀉病原菌［22］。碳青霉烯類抗生素作為治療大腸埃希菌感染首選藥物之一，近年來廣泛的使用，導致大腸埃希菌對此類抗生素耐藥性持續(xù)增加［23］。密度感應系統(tǒng)參與微生物發(fā)光、產(chǎn)孢、耐藥性、生物膜和毒力因子分泌等生命過程，受到研究者的廣泛關注［24-25］。密度感應系統(tǒng)是一種細菌細胞間的通信機制，包括細胞外誘導劑信號分子的產(chǎn)生、檢測和響應。本研究使用Thermotagetron 系統(tǒng)，成功構(gòu)建了大腸埃希菌HMS174 密度調(diào)節(jié)子（qseC）基因失活突變株，通過對比研究野生型菌株與ΔqseC627s 的表型差異，鑒定qseC 基因的生理功能。

我們發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，ΔqseC627s 突變株的生長能力變?nèi)?，溶血能力喪失，運動能力與生物膜形成能力顯著降低，以上表型與大腸埃希菌致病力密切相關，可見qseC基因?qū)Υ竽c埃希菌的致病力具有重要貢獻。革蘭陰性菌的溶血能力受到細菌第六型分泌系統(tǒng)（Type ⅥSecretion Systems，T6SS）的調(diào)控，并反饋調(diào)節(jié)T6SS 系統(tǒng)［26］，qseC基因的缺失可能使T6SS 系統(tǒng)無法分泌溶血蛋白，造成ΔqseC627s 溶血能力消失。在哈維支弧菌（Vibrio harveyi）中群體感應系統(tǒng)影響其鞭蛋白合成［27］，大腸埃希菌的鞭毛是其運動器官和宿主黏附因子，qseC 基因的缺失，可能造成鞭毛蛋白合成受阻，導致其運動能力降低。ΔqseC627s 突變株生物膜形成能力顯著降低，由于生物膜是大腸埃希菌對抗外界環(huán)境的保護性結(jié)構(gòu)。生物膜合成受阻，可能是大腸埃希菌對酸堿的耐受性和對抗生素耐受性降低的原因。例如在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，生物膜與其毒力和耐藥性密切相關［28］。綜上所述，qseC基因失活后，大腸埃希菌致病相關表型減弱、致病力降低，因此qseC基因可作為治療大腸埃希菌感染的潛在靶點。