曹志威 邵國 趙志軍 張春陽

1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院（內(nèi)蒙古包頭014000）；2內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（內(nèi)蒙古包頭014000）；3包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所（轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）（內(nèi)蒙古包頭014000）；4內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心（內(nèi)蒙古包頭014000）；5深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（廣東深圳518172）

繼發(fā)于先天性疾病、創(chuàng)傷或顱腦手術(shù)所致的顱骨缺損是神經(jīng)外科中常見且重要的臨床問題。由顱骨缺損引起的認(rèn)知缺陷、記憶受損、運(yùn)動(dòng)障礙以及心理問題在患者中十分常見。關(guān)于顱骨缺損修補(bǔ)的研究在近年來取得了很大進(jìn)展，修補(bǔ)策略包括來自患者自體骨、同種異體骨、異種骨和合成材料。移植材料對(duì)取材部位的額外損傷、需要二次手術(shù)以及有限可獲得性等抑制了自體骨移植的發(fā)展［1-2］；同種異體骨移植則受到嚴(yán)重失敗率、機(jī)械穩(wěn)定性差和免疫排斥等問題的阻礙［3-4］；而合成材料從鈦到羥基磷灰石，有機(jī)物質(zhì)如膠原等，其可能具有優(yōu)異的機(jī)械性能，但它們與宿主骨整合和生長的能力是有限的。

在骨組織工程和再生領(lǐng)域，幾種干細(xì)胞已經(jīng)用于治療顱骨缺損，干細(xì)胞成骨分化后移植已被證明是骨再生潛在可行的臨床策略，而移植干細(xì)胞促進(jìn)顱骨修復(fù)和再生的機(jī)制仍存在較大爭議［5］。移植的細(xì)胞能否在體內(nèi)長期存活并直接對(duì)修復(fù)做出貢獻(xiàn)，還是它們會(huì)在移植后死亡并通過旁分泌效應(yīng)將細(xì)胞因子釋放到細(xì)胞外［6］，這是目前爭論的重點(diǎn)。本文就不同種類的干細(xì)胞在顱骨缺損修補(bǔ)中的應(yīng)用以及該治療方法的發(fā)展前景進(jìn)行綜述。

1 不同種類干細(xì)胞在顱骨缺損修補(bǔ)中的應(yīng)用

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 長期以來，自體BMSCs一直被認(rèn)為是研究顱骨修補(bǔ)的理想干細(xì)胞來源。一些研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，它可以快速擴(kuò)增分化為各種中胚層譜系，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞［7］，這些細(xì)胞有助于骨、軟骨、肌腱、脂肪、肌肉等間充質(zhì)組織的再生。此外，BMSCs 也可以分化為外胚層型細(xì)胞，例如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）或平滑肌細(xì)胞（SMCs）等［8］。

小鼠BMSCs 已被證明可以修補(bǔ)同基因動(dòng)物的顱骨缺損［9-11］。在修補(bǔ)過程中，需要合適的載體讓BMSCs 停留，首選具有生物相容性和可吸收性的支架構(gòu)成的載體，其可限制組織排斥反應(yīng)并允許缺損部位的骨生長。NAUDOT 等［9］利用三維靜電紡絲和打印技術(shù)制備了蜂窩狀聚已酸內(nèi)酯（PCL）-納米羥基磷灰石（nHA）復(fù)合支架。在大鼠顱骨缺損模型中，該支架和BMSCs 的結(jié)合顯著改善了骨再生和骨礦化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)［12］，外泌體能夠促進(jìn)BMSCs 的增殖、遷移和成骨分化，與純?chǔ)?TCP支架相比，外泌體∕β-TCP 聯(lián)合支架可以有效促進(jìn)顱骨缺損大鼠模型的骨修復(fù)和再生。然而，BMSCs 在臨床應(yīng)用中存在一些實(shí)際缺陷，包括取材易造成患者痛苦、部位受損，并且隨著供體年齡的增加，其增殖和分化能力也會(huì)隨之降低。

如何改善BMSCs 取材方式，減輕其帶來的傷害是關(guān)注點(diǎn)之一。近年來，新興的研究表明，來源于干細(xì)胞的外泌體在干細(xì)胞旁分泌治療機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，可能為未來無細(xì)胞治療提供一種全新的思路。

1.2 脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） ADSCs 是一種從脂肪組織中分離出來的基質(zhì)細(xì)胞群，在形態(tài)和表型上與BMSCs 極其相似。ADSCs 同樣表現(xiàn)出向多系細(xì)胞分化的特征，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞［13］。ADSCs的提取相對(duì)容易，可以從皮下脂肪組織中直接獲得，與BMSCs 的獲取辦法相比，該方法成本更低，創(chuàng)傷更小，細(xì)胞產(chǎn)量更高，供體部位發(fā)病率更低。重要的是，與其他年齡相關(guān)的成人干細(xì)胞相比，ADSCs 的質(zhì)量和增殖能力不會(huì)隨著患者的年齡而下降［14］。因此，作為臨床應(yīng)用的來源，ADSCs 是一種優(yōu)于其他種類的成體干細(xì)胞。

多項(xiàng)研究表明，ADSCs 已成為顱骨缺損修補(bǔ)的可行選擇。WANG 等［15］將ADSCs 種植在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架上能夠促進(jìn)大鼠顱骨缺損的修復(fù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ADSCs 能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF 是血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，而骨修復(fù)過程中需要血管形成，因此ADSCs 對(duì)骨形成有很大的促進(jìn)作用。同樣，STUMBRAS等［16］利用富含生長因子的血漿（PRGF）與ADSCs 聯(lián)合應(yīng)用治療兔顱骨缺損，結(jié)果顯示在骨愈合早期其增強(qiáng)了ADSCs 移植的再生潛能。

1.3 牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）從正畸或者臨床拔除的第三磨牙中獲得的牙髓干細(xì)胞具有分化為外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞的能力，并具有無限的自我更新能力［17］。GRONTHOS等［18］于2000年首次從成人第三磨牙中分離了人牙髓干細(xì)胞（HDPSCs），體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，HDPSCs 與BMSCs 都具有發(fā)展為多細(xì)胞系的潛力，但HDPSCs在體外表現(xiàn)出比BMSCs 更高的增殖率。這可能是由于各個(gè)組織的發(fā)育狀態(tài)不同，因?yàn)榈谌w磨牙是最后一顆完全發(fā)育和萌出的恒牙，與成人骨髓相比，處于較早的發(fā)育狀態(tài)。

LEE 等［19］將HDPSCs 和BMSCs 分別與可 吸收骨材料（Bio-Oss）相結(jié)合，植入兔顱骨缺損處，結(jié)果顯示，二者具有相似的骨密度、新骨形成和成骨相關(guān)蛋白表達(dá)，該體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移植在Bio-Oss上的DPSCs 與BMSCs 的骨再生效果相當(dāng)。此外，近期有研究比較了DPSCs 和ADSCs 在體內(nèi)外的成骨能力［20］，體外結(jié)果表明，DPSCs 具有更強(qiáng)的增殖和遷移能力，可表達(dá)更高的血管生成相關(guān)基因并分泌更多的血管內(nèi)皮生長因子；ADSCs 能高表達(dá)成骨相關(guān)基因并有更多的礦物質(zhì)沉積，展現(xiàn)出了更大的成骨分化潛能。在體內(nèi)，ADSCs 組在移植后1 周就出現(xiàn)了明顯的新骨形成和礦化，而DPSCs 組在移植后3周才開始出現(xiàn)明顯的礦化過程。這些結(jié)果提示ADSCs可能比DPSCs更有利于骨再生。

DPSCs 作為一種未礦化的結(jié)締組織，在拔除和脫落的牙齒中很容易獲取。此外，它們還具有很強(qiáng)的增殖能力與免疫相容性，使其更好地與受體結(jié)合。近年來，因其巨大的分化潛能和非惡性表型，牙髓干細(xì)胞成為了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中臨床研究的熱點(diǎn)之一。然而，DPSCs 在顱骨缺損修補(bǔ)中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究。

1.4 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cell，HAMSCs） HAMSCs 來 源 于胚外中胚層。它們顯示出三系分化潛能，表達(dá)與多能性相關(guān)的標(biāo)記物，如干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子八聚體連接蛋白4（octamer-binding protein 4，Oct-4），并且表達(dá)能力比BMSCs 更強(qiáng)［21］。此外，有研究表明，與BMSCs 相比，二者的形態(tài)和多向分化潛能幾乎一致，但HAMSCs 擁有更強(qiáng)的增殖能力、免疫調(diào)節(jié)能力［22］和旁分泌特性［23］。

近幾年，HAMSCs 在顱骨缺損修補(bǔ)中有大量研究，JIANG 等［24］將HAMSCs 與骨填充材料相結(jié)合用于修補(bǔ)兔顱骨缺損，與對(duì)照組相比，未見明顯的移植反應(yīng)，細(xì)胞能夠存活，影像學(xué)和組織學(xué)結(jié)果提示其促進(jìn)了骨的形成，并加速了骨缺損中的骨礦化。同樣，在另一項(xiàng)研究中［25］，使用HAMSCs 與殼聚糖（Ch）-碳酸磷灰石（CA）支架相結(jié)合修補(bǔ)大鼠顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)移植8 周后，其血管內(nèi)皮生長因子和成骨相關(guān)基因的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。上述實(shí)驗(yàn)提示HAMSCs 可能成為骨組織工程的一種候選種子細(xì)胞。

作為成體干細(xì)胞中的一種，HAMSCs 因其高活性、高純度、高增殖和低免疫原性而引起研究者的關(guān)注，但成骨能力似乎并沒有達(dá)到人們的預(yù)期，如何提高其成骨能力將是未來研究的重點(diǎn)。

2 提高干細(xì)胞治療效率的途徑

盡管以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方法是顱骨缺損修補(bǔ)中一種極具前景的手段，但此方法在人體內(nèi)的療效仍不明確，不能廣泛應(yīng)用于臨床，干細(xì)胞的植入率和存活率低是主要原因，這可能與顱骨缺損處惡劣的微環(huán)境有關(guān)。此外，干細(xì)胞的搭載材料也是影響治療效果的一個(gè)重要因素。盡管研究者們?cè)噲D通過應(yīng)用各種材料來模擬自然骨支架，甚至將含有納米纖維的大通道支架與間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合［26］以修補(bǔ)顱骨缺損，但療效喜憂參半。為了克服這些問題，提高干細(xì)胞治療的效率，人們研究了許多不同的方法，現(xiàn)總結(jié)如下。

2.1 搭載細(xì)胞的仿生工程材料 自20 多年前骨組織工程的概念提出后，顱面骨再生技術(shù)得到了飛速發(fā)展。在顱骨損傷修補(bǔ)的過程中，可以定制仿生材料來調(diào)節(jié)細(xì)胞所處的微環(huán)境，這意味著人們能夠通過調(diào)整不同生物材料的成分、結(jié)構(gòu)和特性來控制骨再生的速度。

這些生物材料通常由具有生物相容性和可吸收的支架組成，以限制組織排斥反應(yīng)并為細(xì)胞附著、增殖、分化和新組織再生提供合適的環(huán)境［27］。這些支架分為無機(jī)和有機(jī)兩種，其中無機(jī)支架以磷酸鈣（CAP）生物陶瓷為代表，有機(jī)支架主要由天然或合成的生物聚合物形成，在這些有機(jī)支架聚合物中，人工合成的聚己內(nèi)酯（PCL）是長期植入物和組織工程支架的極佳候選材料［28］。除此之外，支架的結(jié)構(gòu)和孔隙大小也在促成骨過程中起著重要作用。近年來，電紡支架因其靈活性、易用性、成本效益、對(duì)齊結(jié)構(gòu)和控制纖維直徑的能力而受到極大關(guān)注［29］。

目前，仿生工程材料的選擇已成為一個(gè)熱門領(lǐng)域，眾多研究者試圖規(guī)避各種材料的缺點(diǎn)，并探索新的特性材料來運(yùn)用到支架制備中，這將是干細(xì)胞移植治療的新趨勢(shì)。

2.2 生長因子修飾 許多生長因子已被證明在顱骨生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和骨形態(tài)蛋白（BMPs）［30］。在體內(nèi)，生長因子通過與不同的細(xì)胞外基質(zhì)分子結(jié)合而受到保護(hù)。選擇合適的生物材料載體系統(tǒng)對(duì)單個(gè)或多個(gè)生長因子的局部和持續(xù)釋放一直被認(rèn)為是至關(guān)重要的。

目前這些生長因子通常是通過化學(xué)或物理方式將其包埋在生物材料里。PATEL 等［31］將VEGF和BMP-2 輸送至大鼠顱骨缺損模型中，展示了完全的骨再生能力。此外，近期研究表明，對(duì)生長因子進(jìn)行基因修飾后可以增強(qiáng)支架的功能，RAFTERY 等［32］將改良后的BMP-2 質(zhì)粒植入膠原羥基磷灰石支架中，能夠顯著提高支架內(nèi)搭載的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力。

2.3 預(yù)處理干細(xì)胞 為了提高移植細(xì)胞的存活率及在體內(nèi)的成骨能力，人們提出在移植前對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，以減少細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)功能，并向特定方向分化。

目前大多數(shù)觀點(diǎn)主張，將干細(xì)胞在體外成骨誘導(dǎo)一段時(shí)間后與支架結(jié)合移植入體內(nèi)，這樣做的目的在于能夠避免體內(nèi)環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響并使其向成骨細(xì)胞特異性分化［33］。然而，一項(xiàng)研究的結(jié)果出乎意料，LI 等［34］認(rèn)為未誘導(dǎo)的ADSCs 也可作為種子細(xì)胞用于構(gòu)建骨組織工程，該實(shí)驗(yàn)表明未誘導(dǎo)的ADSCs 與成骨誘導(dǎo)的ADSCs 在新骨形成方面并無明顯差異，在體內(nèi)也能成骨，這種結(jié)果或許與細(xì)胞狀態(tài)和材料選擇等有一定關(guān)系，不過預(yù)處理干細(xì)胞似乎更被認(rèn)可。

2.4 多細(xì)胞聯(lián)合治療 為達(dá)到最佳修補(bǔ)效果，有人研究了不同種類的干細(xì)胞聯(lián)合治療顱骨缺損。JIANG 等［24］利 用HAMSCs 和HBMSCs 都具 有 成骨能力但又有不同方面的優(yōu)勢(shì)，使用Transwell 系統(tǒng)對(duì)二者進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明二者共培養(yǎng)時(shí)，形成的礦化結(jié)節(jié)比單獨(dú)培養(yǎng)更加明顯，其成骨標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)均顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)說明二者能相互促進(jìn)成骨，起到更好的治療效果。此外，另幾個(gè)研究小組的數(shù)據(jù)顯示，與單一種子細(xì)胞相比，ADSCs 與內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）共培養(yǎng)可促進(jìn)大鼠顱骨缺損的血管化骨再生［35］。與單純3D 打印羥基磷灰石∕凝膠納米（HAP-GEL）支架相比，通過BMSCs 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與3D 打印HAP-GEL 支架材料共培養(yǎng)移植到缺損顱骨處，可增強(qiáng)骨修復(fù)能力［36］。

上述結(jié)果表明，不同種類干細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)提高修補(bǔ)效果是有希望的，細(xì)胞-細(xì)胞的互補(bǔ)和協(xié)同作用，將克服任何單一干細(xì)胞類型的不足。

3 總結(jié)與展望

顱骨缺損后修補(bǔ)材料及修補(bǔ)風(fēng)險(xiǎn)等問題一直是神經(jīng)外科探討的焦點(diǎn)。在缺乏特異性靶向治療的情況下，目前顱骨缺損的治療主要依靠各種仿生材料進(jìn)行修補(bǔ)?；诟杉?xì)胞的復(fù)合支架在許多動(dòng)物研究中已被證明具有顱骨修復(fù)的能力，基因工程、預(yù)處理和骨組織工程已被廣泛應(yīng)用于提高干細(xì)胞治療的療效，多種干細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高干細(xì)胞治療的效果。此外，通過改變固有的生物材料特性以調(diào)節(jié)干細(xì)胞在宿主體內(nèi)命運(yùn)的創(chuàng)新方法，不僅對(duì)促進(jìn)顱骨再生有重要意義，而且將消除使用生化誘導(dǎo)劑或可溶性因子帶來的副作用。綜上所述，目前國內(nèi)外對(duì)干細(xì)胞治療的理解以及新興方法的發(fā)現(xiàn)能更好擴(kuò)大干細(xì)胞治療顱骨缺損的臨床應(yīng)用。