再努熱·阿不拉汗 熱迪娜·亞生 韓 晶

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)科，烏魯木齊市 833000，電子郵箱：C13989508@163.com)

近年來，缺血性腦卒中已成為我國居民死亡的主要原因之一[1]。大腦中動脈缺血會影響腦組織的血液循環(huán)，使得腦組織的氧氣和葡萄糖供給不足。由于腦組織的高能耗性與易損性，較長時間的血氧剝奪會導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)損傷[2]。目前，溶栓治療是缺血性腦卒中的首選治療方案，然而較短的治療時間窗及較危險的副作用限制了溶栓治療的應(yīng)用[3]。因此，亟須探尋預(yù)防缺血性腦卒中的發(fā)生或減輕缺血性腦卒中后的腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙的有效措施。

已有較多文獻(xiàn)報告，缺血性腦卒中后長期運(yùn)動有助于患者康復(fù)，其機(jī)制包括抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化從而減少炎癥反應(yīng)[4-5]，增加神經(jīng)保護(hù)因子的分泌從而促進(jìn)神經(jīng)元新生[6]，以及減少神經(jīng)元凋亡從而緩解血腦屏障破壞[7]。然而，發(fā)病前長期運(yùn)動是否有助于改善缺血性腦卒中后的腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙，其機(jī)制是否與降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)，卻鮮有研究報告。因此，本研究擬采用跑步與游泳強(qiáng)迫大鼠鍛煉，再通過線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中模型，探究長期運(yùn)動預(yù)處理對缺血性腦卒中后腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙的改善作用及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 10周齡成年雄性SD大鼠36只，清潔級，體質(zhì)量(230±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2018-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度(60±5)%，室內(nèi)溫度(24±2)℃，噪聲小于50 dB，正常晝夜交換節(jié)律，室內(nèi)通風(fēng)良好，充足的食物與水源，為了保證大鼠有充足的自主活動空間，每籠大鼠不多于4只。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、腦缺血組、運(yùn)動+腦缺血組，每組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 L3400線栓購自廣州佳靈生物技術(shù)公司，抗兔離子化鈣結(jié)合適配分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)抗體(批號：bs-718240)、抗小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)抗體(批號：bs-709432)、抗小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)抗體(批號：bs-758321)、抗兔白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6抗體(批號：bs-795843)、抗兔IL-1β抗體(批號：bs-712183)、抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(批號：bs-728732)均購自北京博奧森公司；酶標(biāo)山羊抗鼠Ig(H+L)抗體(批號：65-19-768)、RIPA裂解液(批號：7018-905)購自上海碧云天公司；氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)(批號：80417-793)、免疫組化試劑盒(批號：60029-132)均購自北京索萊寶公司。

1.3 長期運(yùn)動方案 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，運(yùn)動+腦缺血組大鼠開始連續(xù)4周的運(yùn)動訓(xùn)練。每天上午，將大鼠放到自動跑步機(jī)(上海玉研儀器公司，型號：IITC Model 800)上跑步。設(shè)置動物程序?yàn)椋河?0 m/min至25 m/min緩慢提速，然后再緩慢降速，升速、降速的加速度均為1 m/min2，跑步時間共30 min；跑步機(jī)尾部設(shè)置電擊以刺激大鼠向前跑步，電流強(qiáng)度為1.0 mA。每天下午，將大鼠投入一個裝滿水的圓柱形水桶(直徑1.6 m，水高0.4 m)中，進(jìn)行游泳運(yùn)動，設(shè)置水溫為(24±1)℃，15 min/次。在運(yùn)動+腦缺血組大鼠進(jìn)行強(qiáng)迫鍛煉時，將其他兩組大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的曠場中自由活動。所有大鼠均連續(xù)運(yùn)動或活動4周。

1.4 腦缺血模型的構(gòu)建方法 運(yùn)動干預(yù)結(jié)束后，參考文獻(xiàn)[8]中的方法建立腦缺血模型。取腦缺血組和運(yùn)動+腦缺血組大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，以按壓腳趾無反應(yīng)為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)。將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)臺上，給予頸部正中區(qū)域消毒后剃毛，使用手術(shù)刀片做一約1.5 cm的縱向切口，沿肌肉組織向下分離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠(yuǎn)心端，止血鉗夾閉頸內(nèi)動脈。頸總動脈剪開一個小口，插入線栓，松開止血鉗，沿頸內(nèi)動脈前進(jìn)至大腦中動脈，進(jìn)入距離分叉處15～17 mm，封閉大腦中動脈血流。固定線栓，維持2 h。再次注射少量戊巴比妥鈉維持麻醉狀態(tài)，輔助拔出線栓并結(jié)扎頸總動脈避免出血，縫合傷口，放入鼠籠中。按照上述的方法，給予假手術(shù)組大鼠麻醉、頸部消毒后做切口，分離出頸動脈后縫合傷口。建立腦缺血模型的大鼠于術(shù)后2～3 h順利蘇醒，腦缺血區(qū)所支配的對側(cè)前肢無法伸展，按壓時反應(yīng)遲鈍，提示造模成功。如出現(xiàn)大鼠死亡情況，則補(bǔ)充至每組12只。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分 拔出線栓24 h后，參考Zea Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)[8]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(假手術(shù)組同一時間點(diǎn)進(jìn)行評分)。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，四肢正常，可自由行走；1分，大鼠可正常行走，但提起大鼠懸空時，大鼠右側(cè)前肢無法完全伸展，呈屈曲、抬高、肩內(nèi)收；2分，在1分表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，存在向前癱瘓且有右側(cè)旋轉(zhuǎn)行走征象；3分，在2分表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)側(cè)推易跌倒，行走較為困難；4分，大鼠無法自主活動，癱瘓且部分意識喪失。

1.6 腦水腫程度的評估 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機(jī)數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，迅速斷頭。完整取出大鼠腦組織，去除多余組織，吸干表面水分，電子秤稱量大腦質(zhì)量，記為濕重；將腦組織放入105℃烘箱中干燥去濕，6 h后稱重，之后每隔1 h稱一次質(zhì)量，當(dāng)連續(xù)稱重3次前后差值少于0.3 mg時則記錄最后一次質(zhì)量為干重。根據(jù)公式計算得腦水腫程度，即[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.7 TTC染色法評估腦梗死體積 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機(jī)數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，迅速斷頭。將腦組織取出后，置于-20℃冰箱中冷凍30 min，當(dāng)腦組織僵硬且易于切片時取出。使用鋒利的刀片將腦組織自距額極約4 mm外作連續(xù)的冠狀切片，每片厚度約3 mm，約5片。將切片浸泡于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，每4 min翻動一次切片。將TTC溶液傾去，加入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，30 min后將腦組織切片按順序一次排列，使用數(shù)碼攝像機(jī)拍攝。正常腦組織被TTC溶液染成玫瑰紅色，梗死區(qū)域著色為白色。利用Image-Pro Plus軟件測量腦組織切片白色區(qū)域面積，并計算腦梗死體積，以梗死體積占全腦體積百分比來表示腦梗死程度。

1.8 免疫組化染色檢測Iba1和TLR4的表達(dá)情況 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機(jī)數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，剪開胸骨，暴露胸腔。使用生理鹽水灌注沖盡血液，再以4%多聚甲醛灌注固定組織。斷頭取腦，將腦組織放入4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定3 d。取出腦組織，梯度乙醇脫水，對腦組織進(jìn)行石蠟包埋，然后將石蠟包埋組織切成約4 μm厚的切片。將切好的石蠟切片放于45℃溫水中展開，移至玻片上鋪平，60℃烤片100 min。切片上滴加1%牛血清蛋白封閉液，室溫封閉2 h，磷酸緩沖鹽溶液漂洗玻片3次，切片上滴加抗兔Iba1單克隆抗體(1 ∶200)與抗小鼠TLR4單克隆抗體稀釋液(1 ∶200)，并在4℃條件下孵育過夜。次日，取出腦組織切片，磷酸緩沖鹽溶液漂洗玻片3次，滴加酶標(biāo)山羊抗鼠Ig(H+L)抗體稀釋液(1 ∶200)，24℃條件下孵育2 h。磷酸緩沖鹽溶液洗滌玻片3次，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺底物復(fù)合物中孵育顯色3～15 min，雙蒸水充分沖洗，蘇木精復(fù)染20 s，然后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片，重點(diǎn)觀察缺血側(cè)海馬區(qū)與前額皮層區(qū)。可見棕黃色顆粒則判定為樣本陽性表達(dá)，通過軟件Image-Pro Plus 6.0測定陽性表達(dá)區(qū)的光度值，以假手術(shù)組樣本光度值的平均值為基值進(jìn)行歸一化統(tǒng)計。

1.9 免疫印跡試驗(yàn)檢測炎性因子的蛋白表達(dá)情況 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機(jī)數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，迅速斷頭。取出腦組織后，鑷取缺血側(cè)海馬組織與皮層組織部位，稱重質(zhì)量后加入RIPA裂解液提取總蛋白，裂解液與組織體積質(zhì)量比為4 ∶1。將海馬組織或皮層組織研磨成細(xì)胞懸液，4℃冰箱中靜置30 min以充分提取蛋白。12 000 r/min離心30 min，吸取上清液，加入上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白變性。配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，取出上樣梳，每孔加入約10 μg樣品進(jìn)行電泳。設(shè)置電泳條件為恒壓30 V/30 min、90 V/90 min，整個電泳以上樣緩沖液到達(dá)凝膠底部設(shè)為電泳終點(diǎn)。根據(jù)分子標(biāo)記Marker截取目的蛋白凝膠條帶，使用濕法轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白自凝膠條帶上轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件為恒流2 mA，時間60 min，整個轉(zhuǎn)膜過程保持冰水浴。取出聚偏二氟乙烯膜，浸沒于4%脫脂奶粉溶液中，封閉2 h，避免抗原與抗體非特異性結(jié)合。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌聚偏二氟乙烯膜，分別加入一抗稀釋液，包括抗小鼠TNF-α抗體(1 ∶1 000)、抗兔IL-6抗體(1 ∶1 000)、抗兔IL-1β抗體(1 ∶1 000)、抗小鼠GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4℃條件下孵育過夜。次日，取出聚偏二氟乙烯膜，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG(H+L)二抗稀釋液(1 ∶2 000)，室溫條件避光孵育2 h。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，于條帶上滴加ECL超敏發(fā)光液，顯影儀下顯影，使用Image J圖像分析軟件獲取蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用GraphPad 7.0軟件進(jìn)行繪圖。計量資料以(x±s)表示，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差進(jìn)行比較，應(yīng)用Tukey檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 長期運(yùn)動對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的影響 假手術(shù)組大鼠沒有出現(xiàn)任何行為學(xué)異常，能夠自由行走且活躍度較高；腦缺血組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，主要表現(xiàn)為行動遲緩，右側(cè)前肢無法完全伸直，且僅能向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，部分大鼠側(cè)推易跌倒；運(yùn)動+腦缺血組大鼠主要表現(xiàn)為一側(cè)前肢無法伸展，但行動活躍且平衡能力較強(qiáng)，神經(jīng)功能障礙較腦缺血組改善。3組大鼠神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，腦缺血組、運(yùn)動+腦缺血組、假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分依次降低(均P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分的比較(x±s，分)

2.2 長期運(yùn)動對大鼠腦缺血后腦水腫和腦梗死程度的影響 腦缺血組和運(yùn)動+腦缺血組大鼠腦組織水腫程度較假手術(shù)組嚴(yán)重，但運(yùn)動+腦缺血組大鼠腦組織水腫程度較腦缺血組減輕(均P<0.05)，見表2。假手術(shù)組腦組織TTC染色為紅色，腦缺血組和運(yùn)動+腦缺血組大鼠腦組織出現(xiàn)不同程度的白色梗死區(qū)域，腦梗死程度均較假手術(shù)組嚴(yán)重，但運(yùn)動+腦缺血組大鼠腦梗死程度較腦缺血組減輕(均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 3組大鼠腦水腫和腦梗死程度的比較(x±s，%)

圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)域

2.3 長期運(yùn)動對大鼠腦缺血后腦組織中Iba1和TLR4表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬區(qū)與前額皮層中Iba1和TLR4的表達(dá)量均增加(均P<0.05)；與腦缺血組相比，運(yùn)動+腦缺血組海馬區(qū)與前額皮層中Iba1和TLR4的表達(dá)量均降低(均P<0.05)。見表3和圖2、圖3。

表3 3組大鼠腦組織中Iba1和TLR4相對表達(dá)量的比較(x±s)

圖2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)與前額皮層中Iba1表達(dá)水平(免疫組化染色，×20)

圖3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)與前額皮層中TLR4表達(dá)水平(免疫組化染色，×20)

2.4 長期運(yùn)動對大鼠腦缺血后腦組織中促炎性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬區(qū)與前額皮層中TNF-α、IL-1β與IL-6的蛋白相對表達(dá)量均增加(均P<0.05)；與腦缺血組相比，運(yùn)動+腦缺血組大鼠海馬區(qū)與前額皮層中TNF-α、IL-1β與IL-6的蛋白相對表達(dá)量均降低(均P<0.05)。見表4、圖4、圖5。

表4 3組大鼠腦組織中促炎性細(xì)胞因子蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

圖4 各組(各2只)大鼠海馬組織中促炎性細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)情況

圖5 各組(各2只)大鼠前額皮層組織中促炎性細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)情況

3 討 論

缺血性腦卒中是全球性的公共衛(wèi)生問題，其高致殘率和高致死率與缺血性腦損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]。缺血性腦卒中的病理機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種因素，如神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元再生抑制等[10]。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了該病發(fā)生與進(jìn)展的整個過程，是影響缺血性腦卒中患者預(yù)后的重要因素之一[11]。

已有較多文獻(xiàn)報告，缺血性腦卒中發(fā)病后進(jìn)行長期運(yùn)動可發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[4-6]。在臨床中，長期輔助運(yùn)動是腦卒中患者康復(fù)管理的重要措施之一[12]。然而，發(fā)病前長期運(yùn)動對減輕缺血性腦卒中發(fā)生后神經(jīng)功能障礙的作用及其機(jī)制鮮有研究報告。本研究首先強(qiáng)迫大鼠進(jìn)行為期4周的跑步、游泳混合鍛煉，然后采用線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中模型，在建模24 h后評估大鼠的神經(jīng)功能、腦水腫程度與腦梗死體積。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動預(yù)處理能改善缺血性腦卒中引起的腦水腫與腦組織梗死，降低神經(jīng)功能評分。不同負(fù)荷運(yùn)動會誘導(dǎo)腦組織出現(xiàn)間歇性缺血缺氧狀態(tài)，這種短暫、高頻的生理缺血能夠提高人體血氧重新分配能力，提高機(jī)體的抗缺血缺氧能力，增強(qiáng)腦組織自我保護(hù)能力[13]。因此，缺血前長期運(yùn)動本質(zhì)上是通過一定的刺激手段，誘發(fā)機(jī)體內(nèi)源性自我保護(hù)反應(yīng)，從而快速適應(yīng)缺血再灌注的刺激，及時做出反應(yīng),保護(hù)腦功能。

IL-1β，IL-6與TNF-α是缺血性腦卒中領(lǐng)域中被廣泛研究的促炎性細(xì)胞因子。這3種細(xì)胞因子主要是由活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌，在缺血性腦卒中的進(jìn)展中扮演重要角色[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，給予能夠?qū)笽L-1β與TNF-α的中和抗體進(jìn)行預(yù)處理，能有效縮小缺血性腦卒中小鼠的腦梗死體積[15]。此外，紋狀體內(nèi)注射外源性重組IL-1β則會加劇缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷[16]。IL-6是一種多效促炎性細(xì)胞因子，在缺血性腦卒中中IL-6的作用仍存在爭議。Loddick等[17]發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射外源性重組IL-6可以顯著降低大鼠腦缺血再灌注后腦水腫程度，部分恢復(fù)大鼠的神經(jīng)功能。但多數(shù)研究報告IL-6表達(dá)降低在缺血性腦卒中模型中發(fā)揮著強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用[18]。本研究中，腦缺血組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白相對表達(dá)量均較假手術(shù)組增加(均P<0.05)，提示IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高在急性缺血性腦卒中的發(fā)生中具有重要作用；而運(yùn)動+腦缺血組大鼠腦組織中上述因子的蛋白相對表達(dá)量均較腦缺血組降低(均P<0.05)，表明長期運(yùn)動可有效地降低缺血性腦卒中后大鼠腦組織中促炎因子的表達(dá)。

促炎性細(xì)胞因子在缺血性腦卒中進(jìn)展中扮演重要角色，而小膠質(zhì)細(xì)胞快速激活是誘發(fā)炎癥的關(guān)鍵反應(yīng)[19]。靜息狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞通過較長突觸對腦實(shí)質(zhì)起監(jiān)視作用；當(dāng)發(fā)生血氧供應(yīng)不足時，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速進(jìn)入活化狀態(tài)，吞噬壞死細(xì)胞，釋放出大量促炎性細(xì)胞因子誘發(fā)腦組織炎癥反應(yīng)[20]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活對于宿主防御、清除碎片和組織修復(fù)是必需的，但小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活會分泌各種細(xì)胞因子來殺死其他細(xì)胞，這進(jìn)一步加重了缺氧條件下的腦組織損傷[21]。因此，靶向抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化已成為缺血性腦卒中的治療策略。TLR4是小膠質(zhì)細(xì)胞膜上一種重要的模式識別受體，在與配體結(jié)合時會使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[22]。而Iba1則是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性識別抗體，在小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化時會過度表達(dá)[23]。因此，TLR4與Iba1的表達(dá)共同反映了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，兩者的表達(dá)隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的活化而增加。本研究中，中動脈缺血造成了TLR4與Iba1表達(dá)協(xié)同增加;然而，模型構(gòu)建前長期運(yùn)動顯著地逆轉(zhuǎn)了缺血性腦卒中介導(dǎo)的TLR4表達(dá)增加，降低了小膠質(zhì)細(xì)胞活化指標(biāo)Iba1的表達(dá)。由此推測，長期運(yùn)動可通過抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，發(fā)病前的長期運(yùn)動有助于減輕缺血性腦卒中后大鼠的腦水腫和腦梗死程度，改善神經(jīng)功能障礙，其機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)相關(guān)。因此，對于缺血性腦卒中的高發(fā)人群，如糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化患者[24]，或者常飲酒、血壓、血脂較高的老齡人群[25]，應(yīng)鼓勵其加強(qiáng)體育鍛煉，以減輕缺血性腦卒中后的腦組織損傷和神經(jīng)功能損傷。