張立強(qiáng)，雷 靜

寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏銀川 750011

0 引言

在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，根據(jù)發(fā)病原因可以分為環(huán)境性乳房炎和傳染性乳房炎。傳染性乳房炎通常由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等細(xì)菌導(dǎo)致[1]，其中金黃色葡萄球菌引起的乳房炎導(dǎo)致的奶牛死淘率最高且治療困難，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大損失[2]。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中的空氣、土壤、水等環(huán)境中[2]。研究表明，由金葡菌引起的奶牛乳房炎感染情況僅低于大腸桿菌[3，4]。金黃色葡萄球菌可以損害乳房上皮細(xì)胞和腺泡的功能，使奶產(chǎn)量迅速下降，嚴(yán)重威脅奶牛健康和牧場的經(jīng)濟(jì)效益。此外，金黃色葡萄球菌也可經(jīng)傷口進(jìn)入犢牛血液，導(dǎo)致犢牛發(fā)生菌血癥，感染眼部發(fā)生結(jié)膜炎[6]，嚴(yán)重時(shí)可透過血腦屏障導(dǎo)致犢牛發(fā)生腦膜炎[5]。為此，本研究通過流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室診斷及分子生物學(xué)鑒定等方法對寧夏地區(qū)的規(guī)模牧場進(jìn)行金黃色葡萄球菌流行情況的調(diào)查，并對分離菌進(jìn)行了耐藥性分析，為寧夏地區(qū)金黃色葡萄球菌導(dǎo)致乳房炎的預(yù)防提供合理的用藥指導(dǎo)。

1 材料

1.1 試劑

LB肉湯培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液，珠海貝索生物技術(shù)有限公司；2×TaqPlus Master mix Ⅱ，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Trans DNA Maker Ⅰ，北京全式金生物技術(shù)有限公司；SuperRde核酸染液，合肥蘭杰柯科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，京天根生化科技有限公司；藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 儀器

光學(xué)顯微鏡，Olympus公司；高壓滅菌器，Hirayama公司；電子分析天平、電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；超凈工作臺，上海鴻都電子科技有限公司；離心機(jī)，Sigma公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱、全自動振蕩培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；PCR擴(kuò)增儀，Techne公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；牛博士Ⅲ型體細(xì)胞檢測儀器，華誠睿光（中國）生物科技有限公司。

2 方法

2.1 樣品采集

2021年7—10月，從寧夏地區(qū)銀川市、石嘴山市、吳中市、中衛(wèi)市的6 個(gè)存欄2 000 頭以上的規(guī)模牧場中采集奶樣856 份，見表1。

表1 各牧場采集的奶牛頭數(shù)

具體步驟：根據(jù)各牧場的DHI數(shù)據(jù)和牧場管理軟件系統(tǒng)，篩選出體細(xì)胞數(shù)≥300 萬個(gè)/mL的臨床型乳房炎奶牛進(jìn)行奶樣采集，-4 ℃保存運(yùn)輸。

2.2 金黃色葡萄球菌的分離

取50 μL充分混勻的奶樣，無菌接于含有1 mL的LB肉湯培養(yǎng)基的試管中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)18~24 h后，劃線于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基，挑取形態(tài)相似的菌落接種于1 mL的LB肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)行純化，2 次后，挑取單菌落、進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

2.3 PCR 鑒定

將菌落形態(tài)與金黃色葡萄球菌描述一致，且鏡檢觀察結(jié)果為革蘭氏陽性球菌的菌液樣品按照DNA提取試劑盒描述步驟進(jìn)行DNA提取。金黃色葡萄球菌特異性鑒定引物反應(yīng)條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，見表2。

表2 PCR擴(kuò)增條件及引物序列

2.3 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)

采用革蘭氏陽性球菌敏感性藥物頭孢噻肟、青霉素、萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星、丁胺卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星等。取50 μL純化后的金黃色葡萄球菌菌液滴在貼有7 種不同藥敏紙片的LB瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)藥敏紙片之間的距離≥24 mm，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h后進(jìn)行觀察，并測量LB瓊脂平皿上形成的抑菌環(huán)大小。細(xì)菌對每種藥物的敏感程度按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

3 結(jié)果與分析

3.1 金黃色葡萄球菌鑒定結(jié)果

甘露醇高鹽培養(yǎng)基為金黃色葡萄球菌選擇培養(yǎng)基，在該平皿上長出的為金黃色葡萄球菌菌落（圖1）。金黃色葡萄球菌經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下可以觀察到排列呈葡萄串狀，無芽孢、鞭毛、莢膜的革蘭氏陽性球菌（圖2）。

圖1 甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基

圖2 金葡菌鏡檢圖片（1 000×）

3.2 PCR 鑒定結(jié)果

6 個(gè)規(guī)模牧場所采集的856 份奶樣經(jīng)PCR鑒定為金黃色葡萄球菌的共有467 株。其中A場73 株、B場67 株、C場77 株、D場82 株、E場93 株、F場75 株。擴(kuò)增所產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，為233 bp（圖3）。

3.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星、萬古霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、鏈霉素高度敏感（表3）。

表3 不同藥物對金黃色葡萄球菌的平均抑菌直徑

4 討論

金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎防控的瓶頸是每次治療都可導(dǎo)致大量耐藥性菌株的出現(xiàn)，因此檢測菌株對藥物的敏感性可以為獸醫(yī)工作者選擇適合的治療藥物提供有效的依據(jù)[8]。乳房炎在牧場中是非常常見的疾病，使用合理，科學(xué)的方案進(jìn)行預(yù)防、治療乳房炎顯得非常重要，如治療時(shí)應(yīng)選擇高度敏感性藥物并且輪換使用，以此來減少耐藥性的發(fā)生[9，10]。為了降低乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失，牧場應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期對圈舍環(huán)境消毒，保證墊草干燥，提供高質(zhì)量、營養(yǎng)全面的飼料。

本次試驗(yàn)共采集奶樣856 份，其中經(jīng)革蘭氏染色和顯微鏡鏡檢后革蘭氏陽性球菌共811 株，分離率達(dá)95 %，通過PCR鑒定共得到金黃色葡萄球菌467 株，陽性率達(dá)55%；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離出的金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星、萬古霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、鏈霉素敏感，可以作為首選藥物，為寧夏地區(qū)牧場預(yù)防金黃色葡萄球菌乳房炎提供了科學(xué)的依據(jù)。