田麗 周偉 黃星 吳顯偉 張惠勇 鹿振輝 張少言

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染性疾病。耐多藥結核病(Multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)是指對至少包括異煙肼(INH)和利福平在內的2種以上藥物產生耐藥。INH是臨床中常用的一線抗結核藥物，但是由于治療療程長，導致患者中斷治療，可能會產生耐藥性，耐藥的發(fā)生還與MTB的基因突變有關。INH耐藥相關的突變主要發(fā)生于katG和inhA啟動子區(qū)，此外還有ahpC、fabG1、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rv1592c和Rv1772及其啟動子區(qū)等與INH耐藥相關的基因。臨床中常用的其他一二線藥物如鏈霉素、氨硫脲、環(huán)絲氨酸和乙(丙)硫異煙胺等藥物，MTB對其產生的耐藥性比較穩(wěn)定，耐藥后很少復敏；利福平耐藥后復敏率約為4.2%；而INH耐藥后，停藥36周可有88.5%的復敏率[1]。可見，INH在MDR-TB用藥中的特殊性。因此，探究其耐藥機制，明確其耐藥基因突變特點及分布特征亦有助于MDR-TB診治。為明確中國INH耐藥結核分枝桿菌基因突變的分子特征，筆者對中國INH耐藥基因及其啟動子區(qū)突變特征進行總結和分析，為INH耐藥及MDR-TB的診斷和治療提供幫助。

資料和方法

一、 文獻檢索

英文文獻檢索以“Isoniazid resistance AND gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND China”“Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Hong Kong” “Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Macon” 和 “Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Taiwan”檢索式在PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索截止2021年7月15日有關中國耐INH MTB基因突變的研究文獻。

中文文獻檢索以“異煙肼耐藥 并且 基因突變 并且 結核分枝桿菌”為檢索式在中國知網、萬方、維普數(shù)據(jù)庫中檢索截止2021年7月15日有關中國耐INH結核分枝桿菌基因突變的研究文獻。

二、文獻納入和排除標準

1．納入標準：(1)所研究的MTB菌株來源于中國(包括中國香港、中國澳門和中國臺灣地區(qū))；(2)MTB 對INH耐藥表型測定方法為比例法或絕對濃度法；(3)應用DNA測序法、PCR法、基因芯片法或分子線性探針技術測定耐INH MTB突變基因序列；(4)研究結果包含基因突變位點和氨基酸變化等突變信息。

2．排除標準：(1)研究報告基因信息不詳，僅有突變基因但既無突變位點信息又無堿基突變或氨基酸變化等相關信息的文獻；(2)重復報道的文獻，選取研究時間最新及研究菌株數(shù)量最多的文獻，其他則排除；(3)二次研究文獻。

三、文獻篩選和數(shù)據(jù)提取

由2名中醫(yī)學專業(yè)人員嚴格按照納入和排除標準獨立進行文獻的檢索、閱讀和篩選，對不符合納入標準的文獻予以排除，最后進行菌株來源、數(shù)量、突變類型、突變位點、堿基變化或氨基酸變化、突變數(shù)量占比等數(shù)據(jù)的提取和分析。

四、統(tǒng)計學處理

對納入文獻提取的基因突變信息等計數(shù)資料使用Excel 2016軟件進行合并計算。

結 果

一、文獻檢索結果

應用“文獻檢索”中“檢索式”初步檢索到139篇英文文獻，511篇中文文獻。中文文獻來自中國知網249篇，萬方200篇，維普62篇。通過閱讀文獻題目與摘要剔除重復及質量較低文獻，初步篩選出216篇文獻，其中英文文獻 50篇，中文文獻166篇。最后通過下載、閱讀全文共篩選出69篇文獻，其中英文文獻20篇，中文文獻49篇。檢索流程見圖1。納入文獻及菌株信息見表1。

圖1 文獻篩選流程圖

表1 納入文獻菌株信息

二、6393株INH耐藥MTB菌株基因序列分析結果

69項研究共對2000—2019年間24 630株MTB菌株進行了分析。按地區(qū)劃分，中部地區(qū)(河南省、安徽省、湖南省、湖北省、江西省、山西省)共納入5657株，占所納入菌株數(shù)的22.97%；東部地區(qū)(江蘇省、上海市、浙江省、福建省、廣東省、海南省、臺灣省)納入6475株，占26.30%；西部地區(qū)(重慶市、四川省、西藏自治區(qū))納入1380株，占5.60%；南部地區(qū)(香港特別行政區(qū)、澳門特別行政區(qū)、廣西壯族自治區(qū)、貴州省)納入373株，占1.51%；北部地區(qū)(遼寧省、吉林省、黑龍江省、山東省、陜西省、河北省、天津市、寧夏回族自治區(qū)、北京市、內蒙古自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、青海省、甘肅省)納入9932株，占40.32%；未區(qū)分地區(qū)813株，占3.30%。其中有6393株INH耐藥MTB菌株，占全部研究菌株數(shù)的25.96%。并應用DNA測序法、PCR法、基因芯片法或分子線性探針技術測定6393株INH耐藥MTB突變基因序列。95.71%(6119/6393)檢測到基因突變或缺失。其中katG、inhA、ahpC突變發(fā)生最多，分別占77.57%(4595/6393)、15.20%(972/6393)和3.69%(236/6393)。單基因單位點突變占87.80%(5613/6393)，聯(lián)合突變占12.20%(780/6393)。各地區(qū)中東部耐INH菌株最多，katG突變構成比排前三位的依次為東部、北部和中部；inhA突變構成比從高到低依次為東部、中部和北部。具體基因突變情況見表2。各地區(qū)INH耐藥菌株、katG、inhA基因突變菌株及構成比見表3。

表2 INH耐藥基因突變情況

表3 不同地區(qū)INH耐藥基因突變情況

katG基因單個位點突變出現(xiàn)最多的是第315位密碼子的堿基置換或缺失，占INH耐藥菌株總數(shù)的56.22%(3594/6393)。其次是第463位密碼子，占10.03%(641/6393)。此外還有322、295、394位等41種密碼子發(fā)生突變。在發(fā)生突變的315密碼子中，突變類型最多的是315AGC→ACC，占32.13%(2054/6393)，其次為AGC→AAC的改變，占2.72%(174/6393)。氨基酸改變最多的是Ser→Thr(絲氨酸→蘇氨酸)，占34.48%(2204/6393)，此外還有Ser→Asn(絲氨酸→天冬氨酸)、Ser→Gly(絲氨酸→甘氨酸)等形式的氨基酸改變。inhA基因單個位點突變最多的是15密碼子的突變，占10.10%(646/6393)，第8密碼子的突變也較常見。突變形式最常見的是C→T，約占10.03%(641/6393)。ahpC最常見的突變形式是C→T。在一些研究中，還檢測到kasA、efpA、iniA、iniB、iniC等少見耐INH基因的突變。詳見表4。

表4 6393株INH耐藥菌株基因突變情況

討 論

2019年，全球有近50萬例耐利福平結核病(RR-TB)患者，其中78%的患者為MDR-TB[71]。耐藥的發(fā)生與MTB的基因突變有關。主要是由于染色體、編碼藥物靶標的基因或藥物激活酶的突變總體，影響藥物與靶位酶結合而產生耐藥[72]。MDR-TB的定義是基于MTB菌株對INH和利福平的耐藥性，而INH是臨床中治療結核病常用的一線藥物，可見INH在診治結核病中的重要性。在抗結核藥物中，INH的早期殺菌活性最強。有研究表明INH單藥耐藥與接受標準治療的患者治療成功的概率降低和導致耐藥性的風險增加相關[73]。INH是一種前體藥，分枝菌酸是分枝桿菌細胞壁的基本成分，INH結合并抑制一種參與分枝菌酸生物合成的酶inhA，最后導致分枝桿菌細胞死亡。INH需要過氧化氫酶和過氧化物酶或katG的細胞激活，才能轉化為可對分枝桿菌產生毒性作用的活性形式。目前公認的最常見的INH耐藥基因為katG和inhA[74]，最常見的突變密碼子分別為katG315和inhA15。

本研究納入文獻菌株數(shù)西部、南部地區(qū)較少，這與該地區(qū)發(fā)表的相關研究文獻數(shù)量較少有關。在基因突變中，各地區(qū)構成比差異明顯，東部地區(qū)katG和inhA構成比均最高，中部地區(qū)InhA突變構成比較高，北部地區(qū)則katG突變較多。此外研究結果表明在6393株INH耐藥菌株中，katG315(AGC→ACC)、463和inhA15突變最多，與之前國內報道相一致[74]。但是，由于大多數(shù)研究只對目前公認的耐INH的基因katG和inhA進行了測序，并未對aphC、fabG1、kasA、iniA/B/C等少見的基因進行測序。此外觀察的密碼子也多局限于315等常見的產生突變的區(qū)域。而在katG315之外也還有300多個突變在INH耐藥中作用十分重要。所以，由于目前研究技術水平的限制，原始文獻對耐INH基因的檢測并不完全，而所納入的研究時間跨度也較大(2003—2019年)，使得本次結果有所局限。但是本次納入文獻的發(fā)表單位均是結核病定點醫(yī)院和?？漆t(yī)院等專業(yè)機構和部門，所納入的菌株數(shù)量也達到了24 630株，覆蓋了全國除云南省、澳門特別行政區(qū)外的全部省市，也未見既往對全國范圍內INH耐藥基因突變的相關研究，所以本研究在一定程度上可以代表中國INH耐藥MTB菌株的總體情況。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突