田麗 周偉 黃星 吳顯偉 張惠勇 鹿振輝 張少言

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染性疾病。耐多藥結(jié)核病(Multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)是指對(duì)至少包括異煙肼(INH)和利福平在內(nèi)的2種以上藥物產(chǎn)生耐藥。INH是臨床中常用的一線抗結(jié)核藥物，但是由于治療療程長(zhǎng)，導(dǎo)致患者中斷治療，可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性，耐藥的發(fā)生還與MTB的基因突變有關(guān)。INH耐藥相關(guān)的突變主要發(fā)生于katG和inhA啟動(dòng)子區(qū)，此外還有ahpC、fabG1、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rv1592c和Rv1772及其啟動(dòng)子區(qū)等與INH耐藥相關(guān)的基因。臨床中常用的其他一二線藥物如鏈霉素、氨硫脲、環(huán)絲氨酸和乙(丙)硫異煙胺等藥物，MTB對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性比較穩(wěn)定，耐藥后很少?gòu)?fù)敏；利福平耐藥后復(fù)敏率約為4.2%；而INH耐藥后，停藥36周可有88.5%的復(fù)敏率[1]?？梢姡琁NH在MDR-TB用藥中的特殊性。因此，探究其耐藥機(jī)制，明確其耐藥基因突變特點(diǎn)及分布特征亦有助于MDR-TB診治。為明確中國(guó)INH耐藥結(jié)核分枝桿菌基因突變的分子特征，筆者對(duì)中國(guó)INH耐藥基因及其啟動(dòng)子區(qū)突變特征進(jìn)行總結(jié)和分析，為INH耐藥及MDR-TB的診斷和治療提供幫助。

資料和方法

一、 文獻(xiàn)檢索

英文文獻(xiàn)檢索以“Isoniazid resistance AND gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND China”“Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Hong Kong” “Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Macon” 和 “Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Taiwan”檢索式在PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索截止2021年7月15日有關(guān)中國(guó)耐INH MTB基因突變的研究文獻(xiàn)。

中文文獻(xiàn)檢索以“異煙肼耐藥 并且 基因突變 并且 結(jié)核分枝桿菌”為檢索式在中國(guó)知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫中檢索截止2021年7月15日有關(guān)中國(guó)耐INH結(jié)核分枝桿菌基因突變的研究文獻(xiàn)。

二、文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1．納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所研究的MTB菌株來源于中國(guó)(包括中國(guó)香港、中國(guó)澳門和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū))；(2)MTB 對(duì)INH耐藥表型測(cè)定方法為比例法或絕對(duì)濃度法；(3)應(yīng)用DNA測(cè)序法、PCR法、基因芯片法或分子線性探針技術(shù)測(cè)定耐INH MTB突變基因序列；(4)研究結(jié)果包含基因突變位點(diǎn)和氨基酸變化等突變信息。

2．排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究報(bào)告基因信息不詳，僅有突變基因但既無突變位點(diǎn)信息又無堿基突變或氨基酸變化等相關(guān)信息的文獻(xiàn)；(2)重復(fù)報(bào)道的文獻(xiàn)，選取研究時(shí)間最新及研究菌株數(shù)量最多的文獻(xiàn)，其他則排除；(3)二次研究文獻(xiàn)。

三、文獻(xiàn)篩選和數(shù)據(jù)提取

由2名中醫(yī)學(xué)專業(yè)人員嚴(yán)格按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)的檢索、閱讀和篩選，對(duì)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)予以排除，最后進(jìn)行菌株來源、數(shù)量、突變類型、突變位點(diǎn)、堿基變化或氨基酸變化、突變數(shù)量占比等數(shù)據(jù)的提取和分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)納入文獻(xiàn)提取的基因突變信息等計(jì)數(shù)資料使用Excel 2016軟件進(jìn)行合并計(jì)算。

結(jié) 果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果

應(yīng)用“文獻(xiàn)檢索”中“檢索式”初步檢索到139篇英文文獻(xiàn)，511篇中文文獻(xiàn)。中文文獻(xiàn)來自中國(guó)知網(wǎng)249篇，萬方200篇，維普62篇。通過閱讀文獻(xiàn)題目與摘要剔除重復(fù)及質(zhì)量較低文獻(xiàn)，初步篩選出216篇文獻(xiàn)，其中英文文獻(xiàn) 50篇，中文文獻(xiàn)166篇。最后通過下載、閱讀全文共篩選出69篇文獻(xiàn)，其中英文文獻(xiàn)20篇，中文文獻(xiàn)49篇。檢索流程見圖1。納入文獻(xiàn)及菌株信息見表1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

表1 納入文獻(xiàn)菌株信息

二、6393株INH耐藥MTB菌株基因序列分析結(jié)果

69項(xiàng)研究共對(duì)2000—2019年間24 630株MTB菌株進(jìn)行了分析。按地區(qū)劃分，中部地區(qū)(河南省、安徽省、湖南省、湖北省、江西省、山西省)共納入5657株，占所納入菌株數(shù)的22.97%；東部地區(qū)(江蘇省、上海市、浙江省、福建省、廣東省、海南省、臺(tái)灣省)納入6475株，占26.30%；西部地區(qū)(重慶市、四川省、西藏自治區(qū))納入1380株，占5.60%；南部地區(qū)(香港特別行政區(qū)、澳門特別行政區(qū)、廣西壯族自治區(qū)、貴州省)納入373株，占1.51%；北部地區(qū)(遼寧省、吉林省、黑龍江省、山東省、陜西省、河北省、天津市、寧夏回族自治區(qū)、北京市、內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、青海省、甘肅省)納入9932株，占40.32%；未區(qū)分地區(qū)813株，占3.30%。其中有6393株INH耐藥MTB菌株，占全部研究菌株數(shù)的25.96%。并應(yīng)用DNA測(cè)序法、PCR法、基因芯片法或分子線性探針技術(shù)測(cè)定6393株INH耐藥MTB突變基因序列。95.71%(6119/6393)檢測(cè)到基因突變或缺失。其中katG、inhA、ahpC突變發(fā)生最多，分別占77.57%(4595/6393)、15.20%(972/6393)和3.69%(236/6393)。單基因單位點(diǎn)突變占87.80%(5613/6393)，聯(lián)合突變占12.20%(780/6393)。各地區(qū)中東部耐INH菌株最多，katG突變構(gòu)成比排前三位的依次為東部、北部和中部；inhA突變構(gòu)成比從高到低依次為東部、中部和北部。具體基因突變情況見表2。各地區(qū)INH耐藥菌株、katG、inhA基因突變菌株及構(gòu)成比見表3。

表2 INH耐藥基因突變情況

表3 不同地區(qū)INH耐藥基因突變情況

katG基因單個(gè)位點(diǎn)突變出現(xiàn)最多的是第315位密碼子的堿基置換或缺失，占INH耐藥菌株總數(shù)的56.22%(3594/6393)。其次是第463位密碼子，占10.03%(641/6393)。此外還有322、295、394位等41種密碼子發(fā)生突變。在發(fā)生突變的315密碼子中，突變類型最多的是315AGC→ACC，占32.13%(2054/6393)，其次為AGC→AAC的改變，占2.72%(174/6393)。氨基酸改變最多的是Ser→Thr(絲氨酸→蘇氨酸)，占34.48%(2204/6393)，此外還有Ser→Asn(絲氨酸→天冬氨酸)、Ser→Gly(絲氨酸→甘氨酸)等形式的氨基酸改變。inhA基因單個(gè)位點(diǎn)突變最多的是15密碼子的突變，占10.10%(646/6393)，第8密碼子的突變也較常見。突變形式最常見的是C→T，約占10.03%(641/6393)。ahpC最常見的突變形式是C→T。在一些研究中，還檢測(cè)到kasA、efpA、iniA、iniB、iniC等少見耐INH基因的突變。詳見表4。

表4 6393株INH耐藥菌株基因突變情況

討 論

2019年，全球有近50萬例耐利福平結(jié)核病(RR-TB)患者，其中78%的患者為MDR-TB[71]。耐藥的發(fā)生與MTB的基因突變有關(guān)。主要是由于染色體、編碼藥物靶標(biāo)的基因或藥物激活酶的突變總體，影響藥物與靶位酶結(jié)合而產(chǎn)生耐藥[72]。MDR-TB的定義是基于MTB菌株對(duì)INH和利福平的耐藥性，而INH是臨床中治療結(jié)核病常用的一線藥物，可見INH在診治結(jié)核病中的重要性。在抗結(jié)核藥物中，INH的早期殺菌活性最強(qiáng)。有研究表明INH單藥耐藥與接受標(biāo)準(zhǔn)治療的患者治療成功的概率降低和導(dǎo)致耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[73]。INH是一種前體藥，分枝菌酸是分枝桿菌細(xì)胞壁的基本成分，INH結(jié)合并抑制一種參與分枝菌酸生物合成的酶inhA，最后導(dǎo)致分枝桿菌細(xì)胞死亡。INH需要過氧化氫酶和過氧化物酶或katG的細(xì)胞激活，才能轉(zhuǎn)化為可對(duì)分枝桿菌產(chǎn)生毒性作用的活性形式。目前公認(rèn)的最常見的INH耐藥基因?yàn)閗atG和inhA[74]，最常見的突變密碼子分別為katG315和inhA15。

本研究納入文獻(xiàn)菌株數(shù)西部、南部地區(qū)較少，這與該地區(qū)發(fā)表的相關(guān)研究文獻(xiàn)數(shù)量較少有關(guān)。在基因突變中，各地區(qū)構(gòu)成比差異明顯，東部地區(qū)katG和inhA構(gòu)成比均最高，中部地區(qū)InhA突變構(gòu)成比較高，北部地區(qū)則katG突變較多。此外研究結(jié)果表明在6393株INH耐藥菌株中，katG315(AGC→ACC)、463和inhA15突變最多，與之前國(guó)內(nèi)報(bào)道相一致[74]。但是，由于大多數(shù)研究只對(duì)目前公認(rèn)的耐INH的基因katG和inhA進(jìn)行了測(cè)序，并未對(duì)aphC、fabG1、kasA、iniA/B/C等少見的基因進(jìn)行測(cè)序。此外觀察的密碼子也多局限于315等常見的產(chǎn)生突變的區(qū)域。而在katG315之外也還有300多個(gè)突變?cè)贗NH耐藥中作用十分重要。所以，由于目前研究技術(shù)水平的限制，原始文獻(xiàn)對(duì)耐INH基因的檢測(cè)并不完全，而所納入的研究時(shí)間跨度也較大(2003—2019年)，使得本次結(jié)果有所局限。但是本次納入文獻(xiàn)的發(fā)表單位均是結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院和專科醫(yī)院等專業(yè)機(jī)構(gòu)和部門，所納入的菌株數(shù)量也達(dá)到了24 630株，覆蓋了全國(guó)除云南省、澳門特別行政區(qū)外的全部省市，也未見既往對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)INH耐藥基因突變的相關(guān)研究，所以本研究在一定程度上可以代表中國(guó)INH耐藥MTB菌株的總體情況。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突