王 晗，周 滔，徐云東，郭錫漢，倪 娟，汪 旭，*

(1．云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650500；2．云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，TiO2-NPs)在日常生活中應(yīng)用廣泛，其對(duì)人體的遺傳毒性效應(yīng)已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。已有研究表明，TiO2-NPs可在人體多器官尤其是肝臟和肺臟中大量累積[2]。離體情況下，TiO2-NPs可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)、消耗細(xì)胞中谷胱甘肽，引起細(xì)胞炎癥導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3-5]。部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，攝入過量的TiO2-NPs可激活肝、肺細(xì)胞中多種應(yīng)激通路，引起細(xì)胞死亡，進(jìn)而損傷肝、肺等器官[6-7]。

端粒(telomere)是穩(wěn)固真核細(xì)胞染色體末端特殊且重要的結(jié)構(gòu)，端粒長度(telomere length，TL)改變會(huì)影響染色體末端穩(wěn)定和細(xì)胞增殖，誘發(fā)染色體不穩(wěn)定(chromosome instability，CIN)，引起端粒功能紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡甚至癌變[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TiO2-NPs可誘導(dǎo)人正常肝L-02細(xì)胞大量ROS產(chǎn)生、TL縮短、CIN升高[9]。TiO2-NPs的遺傳毒性可通過誘發(fā)TL改變，進(jìn)而導(dǎo)致端粒功能障礙所致?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)表現(xiàn)出了較好的納米顆粒遺傳毒性抑制效應(yīng)[10]。那么，TiO2-NPs誘導(dǎo)的正常細(xì)胞TL改變等遺傳損傷效應(yīng)，是否可以被抗氧化劑NAC抑制，成為本研究探究的重點(diǎn)。因此，本文擬在人肝細(xì)胞L-02及肺細(xì)胞HBE中，采用TiO2-NPs單獨(dú)暴露及其與NAC聯(lián)合暴露，檢測兩種細(xì)胞TL、CIN及細(xì)胞死亡率的改變情況，為研究NAC在抑制TiO2-NPs誘發(fā)遺傳毒性中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株培養(yǎng)及分組處理

人正常肝細(xì)胞L-02(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)和人正常肺上皮細(xì)胞HBE(中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)用TiO2-NPs(Sigma，德國)及NAC(索萊寶，北京)均用超純水配制。為確保TiO2-NPs分散液均勻，每次使用前均需要將分散液置于超聲波清洗儀(220 V，500 W)分散處理20 min。

分別取對(duì)數(shù)生長期的L-02、HBE細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的濃度接種到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為3組，對(duì)照組(正常培養(yǎng)條件，無TiO2-NPs和NAC)，TiO2-NPs(80μg/mL)暴露組、TiO2-NPs(80μg/mL)與NAC(20μmol/L)聯(lián)合暴露組，各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后進(jìn)行檢測。

1.2 過氧化氫檢測

過氧化氫(H2O2)是ROS的主要成分之一，檢測H2O2濃度可在一定程度上反映細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量。利用過氧化氫檢測試劑盒(碧云天，上海)收集各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，取上清液，用酶標(biāo)儀測定D(560)，依據(jù)H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞中H2O2濃度。

1.3 端粒長度測量

利用DNA提取試劑盒(天根，北京)分別提取各組細(xì)胞總DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)進(jìn)行端粒絕對(duì)長度測量，測量基因組拷貝數(shù)的單拷貝基因選用36B4。PCR所需引物、標(biāo)準(zhǔn)品序列及測量及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.4 胞質(zhì)分裂阻斷微核細(xì)胞組分析

分別收集各組細(xì)胞，加入終濃度為4.5μg/mL的細(xì)胞松弛素B培養(yǎng)細(xì)胞28 h，進(jìn)行細(xì)胞涂片；在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡、壞死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞壞死率；以胞質(zhì)分裂阻斷微核細(xì)胞組試驗(yàn)(cytokinesis-block micronucleus cytome assay，CBMNCyt)分析染色體不穩(wěn)定指標(biāo)，即計(jì)數(shù)至少1 000個(gè)雙核細(xì)胞(binucleated cell，BNC)中微核(micronuclei，MN)、核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridges，NPB)及核芽(nuclear bud，NBud)的數(shù)量，并計(jì)算發(fā)生頻率(‰)，三者頻率相加得到細(xì)胞的總CIN頻率，方法和指標(biāo)判別參考文獻(xiàn)[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用軟件GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 NAC與TiO2-NPs暴露對(duì)L-02、HBE細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度的影響

H2O2濃度檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TiO2-NPs暴露72 h，可顯著誘導(dǎo)L-02、HBE細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度升高(L-02細(xì)胞，P＜0.01；HBE細(xì)胞，P=0.04)，當(dāng)TiO2-NPs聯(lián)合NAC暴露72 h后，L-02和HBE細(xì)胞內(nèi)的H2O2濃度仍較對(duì)照組顯著升高(L-02細(xì)胞，P=0.003；HBE細(xì)胞，P=0.006)，而與TiO2-NPs單獨(dú)暴露組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

2.2 NAC對(duì)TiO2-NPs暴露后L-02和HBE細(xì)胞端粒長度的穩(wěn)定作用

對(duì)端粒長度進(jìn)行測量后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TiO2-NPs暴露72 h后可誘導(dǎo)L-02和HBE細(xì)胞TL縮短(均為P＜0.01)；而當(dāng)TiO2-NPs和NAC共同培養(yǎng)72 h后L-02和HBE細(xì)胞的TL與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，并且聯(lián)合暴露下的兩種受試細(xì)胞TL顯著長于TiO2-NPs單獨(dú)暴露組(均為P＜0.01)，見圖2。提示NAC可維持TiO2-NPs暴露下的TL穩(wěn)定。

圖2 TiO2-NPs與NAC暴露72 h后L-02和HBE細(xì)胞端粒長度的變化

2.3 NAC對(duì)TiO2-NPs暴露后L-02和HBE細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的促進(jìn)作用

在肝正常L-02細(xì)胞和肺正常HBE細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，TiO2-NPs暴露均可顯著增加細(xì)胞的CIN(均為P＜0.01)；當(dāng)NAC與TiO2-NPs聯(lián)合暴露時(shí)，L-02和HBE細(xì)胞的CIN較各自對(duì)照組亦顯著升高(L-02細(xì)胞，P=0.025；HBE細(xì)胞，P=0.008)。與TiO2-NPs單獨(dú)暴露組相比，NAC和TiO2-NPs聯(lián)合暴露組兩種細(xì)胞的CIN均顯著降低(L-02細(xì)胞，P=0.002；HBE細(xì)胞，P=0.03)，見圖3。

圖3 TiO2-NPs與NAC暴露72 h后L-02和HBE細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性的改變

2.4 NAC對(duì)TiO2-NPs暴露導(dǎo)致的L-02和HBE細(xì)胞死亡的抑制作用

正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞經(jīng)吉姆薩染色制片后，在形態(tài)學(xué)上均有顯著差異。正常細(xì)胞如圖4A所示，形態(tài)學(xué)上凋亡細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜，染色質(zhì)聚集，細(xì)胞著色比正常細(xì)胞深，細(xì)胞核邊界清晰或核分解成核小體，包裹在完整的胞漿或胞膜內(nèi)，并形成大小不一且染色更深的凋亡小體(圖4B)；壞死的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞膨脹、細(xì)胞膜不完整或直接不存在、細(xì)胞核呈無規(guī)則狀且染色較淺(圖4C)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析TiO2-NPs和NAC對(duì)受試細(xì)胞死亡方式的影響時(shí)，研究結(jié)果顯示，TiO2-NPs暴露72 h后L-02和HBE細(xì)胞死亡(凋亡和壞死細(xì)胞總和)率均較對(duì)照組顯著增加(L-02細(xì)胞，P＜0.01；HBE細(xì)胞，P=0.012)，并以細(xì)胞壞死方式為主；而NAC與TiO2-NPs聯(lián)合暴露后細(xì)胞死亡率較TiO2-NPs單獨(dú)暴露組顯著降低(L-02細(xì)胞，P=0.004；HBE細(xì)胞，P=0.007)，且聯(lián)合暴露組與對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4D、F)。值得一提的是，在比較細(xì)胞死亡方式時(shí)發(fā)現(xiàn)，與TiO2-NPs單獨(dú)暴露相比，L-02細(xì)胞和HBE細(xì)胞中，TiO2-NPs和NAC聯(lián)合暴露組的細(xì)胞壞死率均有所減少(圖4E、G)。

圖4 TiO2-NPs與NAC暴露72 h后L-02和HBE細(xì)胞死亡情況

3 討論

TiO2-NPs因其良好的著色性以及獨(dú)特理化性質(zhì)，已廣泛應(yīng)用在化妝品、食品加工等領(lǐng)域[12-13]，普遍認(rèn)為，TiO2-NPs通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS誘發(fā)細(xì)胞氧化脅迫，可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細(xì)胞微核率升高等效應(yīng)，表現(xiàn)出遺傳毒性[3-5，14-17]，抗氧化劑對(duì)其產(chǎn)生的遺傳毒性具有一定抑制作用[18-19]。端粒作為維護(hù)染色體穩(wěn)定性的染色體末端結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞衰老、基因組不穩(wěn)定性密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞TL改變，將誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、死亡異常，甚至產(chǎn)生癌變[20]。

本研究首先將人正常肝細(xì)胞L-02和肺細(xì)胞HBE單獨(dú)暴露于TiO2-NPs中，發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs顯著誘導(dǎo)受試細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度升高，同時(shí)TiO2-NPs暴露后，兩株受試細(xì)胞均表現(xiàn)出TL縮短、CIN率升高以及壞死率上升。本研究提示TiO2-NPs可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而引起細(xì)胞氧化脅迫。正是因?yàn)槎肆Ｗ鳛榘麅?nèi)氧化損傷的敏感位點(diǎn)，易被ROS攻擊[21]，因此在TiO2-NPs暴露下受試細(xì)胞TL縮短、CIN升高，誘發(fā)端粒紊亂，產(chǎn)生遺傳損傷。

在已確定本研究體系中TiO2-NPs可誘發(fā)受試細(xì)胞端粒長度縮短等遺傳損傷的情況下，本研究引入抗氧化劑NAC。當(dāng)TiO2-NPs與NAC聯(lián)合暴露后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC的加入能有效減緩TiO2-NPs暴露后兩種受試細(xì)胞表現(xiàn)出的TL縮短、CIN率及細(xì)胞壞死率升高，尤其是在NAC與TiO2-NPs共暴露下，兩種受試細(xì)胞的TL和細(xì)胞死亡率與對(duì)照組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明NAC展現(xiàn)了良好的拮抗TiO2-NPs遺傳損傷作用。

NAC是一種在國內(nèi)外許多研究中得到證實(shí)的抗氧化物質(zhì)[18，22-23]，已有研究發(fā)現(xiàn)，NAC預(yù)處理可明顯降低納米顆粒對(duì)離體細(xì)胞造成的氧化損傷[9]。同時(shí)在體內(nèi)環(huán)境下NAC同樣可抑制TiO2-NPs的毒性作用。Elnagar等[24]證實(shí)，喂飼NAC可對(duì)TiO2-NPs造成的大鼠睪丸損傷起到一定保護(hù)作用，并能改善TiO2-NPs引發(fā)的DNA損傷。Smallcombe等[25]同樣發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理可減少TiO2-NPs引起的小鼠呼吸道損傷。本文結(jié)果也提示，體外培養(yǎng)條件下，抗氧化劑NAC可以有效抑制或減緩TiO2-NPs在人正常肝細(xì)胞L-02及人正常肺上皮細(xì)胞HBE中引發(fā)的TL異常，降低遺傳毒性發(fā)生。

因TiO2-NPs最顯著的毒性效應(yīng)機(jī)制是造成細(xì)胞氧化脅迫，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，在本實(shí)驗(yàn)中，TiO2-NPs暴露引起了受試細(xì)胞內(nèi)ROS組分之一的H2O2濃度的顯著升高。然而，研究結(jié)果顯示，TiO2-NPs與NAC聯(lián)合暴露并未明顯降低因TiO2-NPs暴露所升高的胞內(nèi)H2O2濃度，一方面可能源于本研究使用的NAC劑量(20μmol/L)及處理時(shí)間(72 h)還不足以完全抵抗高劑量TiO2-NPs(80μg/mL)誘導(dǎo)產(chǎn)生的以H2O2為代表的ROS水平，推測NAC對(duì)TiO2-NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的抑制作用可能依賴于抗氧化劑濃度或處理時(shí)間；另一方面，作為抗氧化劑，NAC在未降低胞內(nèi)ROS水平的情況下，已經(jīng)發(fā)揮了減緩受試細(xì)胞遺傳損傷的效應(yīng)，NAC究竟通過何種分子機(jī)制，在不改變ROS水平前提下有效抑制TiO2-NPs誘導(dǎo)端粒功能紊亂，有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究選用兩種人組織來源的正常細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs在人正常肝細(xì)胞L-02及人正常肺上皮細(xì)胞HBE中暴露72 h后可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過量產(chǎn)生并引起細(xì)胞端粒功能紊亂；而抗氧化劑NAC可有效抑制TiO2-NPs暴露下誘發(fā)的端粒功能紊亂，促進(jìn)細(xì)胞的染色體穩(wěn)定，阻止細(xì)胞死亡。本研究提示，在日常生活中，在避免不了納米顆粒暴露的情況下，補(bǔ)充一定劑量的抗氧化劑如NAC等，可能會(huì)降低納米顆粒暴露引起的細(xì)胞端粒功能紊亂等遺傳毒性。