侍雯婧，張吉芊竹，#，朱江波，張曉芳，王瑞娜，戴小宇，任麗君，田逸君，*

(1．海軍軍醫(yī)大學衛(wèi)生毒理學教研室，上海 200433；2．海軍軍醫(yī)大學藥學系，上海 200433)

暈動病(motion sickness)，也稱為運動病，即指人們日常說的“暈車、暈船、暈機”等，是由多種因素導致人體對運動狀態(tài)錯誤感知的一系列生理反應。常見于乘坐交通工具時，癥狀主要有頭暈、惡心、嘔吐、上腹部不適、面色蒼白、出冷汗等，嚴重的可能會導致冷漠、抑郁，甚至導致認知和運動能力下降[1-2]。該病的發(fā)病機制復雜，目前尚未形成統一的診治規(guī)范，仍以藥物治療為主[3]。相關研究表明苯海拉明對中樞神經系統有抑制作用，可產生鎮(zhèn)靜和嗜睡等抑制作用，從而快速改善眩暈發(fā)作[4]?？Х纫蚴且环N存在于各種植物中的天然生物堿，是消費最廣泛的興奮劑之一。這兩種藥物對處于抑制狀態(tài)的中樞神經尤其有效，對心血管系統具有正性作用，還能促進胃酸分泌及治療偏頭痛等疾病，并在機體的多個系統中發(fā)揮廣泛的作用[5]。Crawford等[6]通過系統回顧有關含咖啡因的食品和飲料對健康成年人大腦認知功能影響的研究發(fā)現，咖啡因補充劑能夠改善睡眠不足者的認知功能，如提高注意力和警惕性，縮短對復雜情況的反應時間以及提升解決問題和推理問題的能力。考慮到苯海拉明抗暈動癥的同時有中樞抑制的副作用。藥物組成復方一直是臨床上用于增強藥物療效、降低藥物不良反應的常用方式。因此通過將苯海拉明與咖啡因組成復方，在發(fā)揮苯海拉明抗暈動癥作用的同時，利用咖啡因降低嗜睡反應的發(fā)生率。迄今為止，國內外未見有關鹽酸苯海拉明咖啡因復方安全性評價方面的研究報道。為提高臨床用藥的安全性，本試驗采用Ames試驗、體外培養(yǎng)中國倉鼠肺細胞(Chinese hamster lung cells，CHL)染色體畸變試驗和ICR小鼠骨髓微核試驗對鹽酸苯海拉明咖啡因復方進行了遺傳毒性檢測，為鹽酸苯海拉明咖啡因復方的臨床合理使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽酸苯海拉明咖啡因復方鹽酸苯海拉明為N，N-二甲基-2-(二苯基甲氧基)乙胺鹽酸鹽(500 g/袋，批號DH-201812104)，由海軍軍醫(yī)大學藥學系提供，白色結晶性粉末，無臭，干燥、陰涼保存，結構式見圖1?？Х纫驗?,3,7-三甲基-3,7-二氫-1H-嘌呤-2,6-二酮一水合物或其無水物(1 000 g/袋，含量為99.8%，批號16112112)，由海軍軍醫(yī)大學藥學系提供，白色有絲光的針狀結晶，無臭，室溫、干燥、密封保存，分子結構式如圖2。經前期文獻[7]調研，分別查閱了苯海拉明和咖啡因單獨應用的安全性相關文獻[8-14]。苯海拉明和咖啡因在臨床常用劑量(苯海拉明12.5～25 mg，咖啡因50～200 mg)下安全。依據小鼠和大鼠藥理學實驗的結果，確定苯海拉明咖啡因復方的藥物組成為苯海拉明∶咖啡因=25 mg∶60 mg。藥效學研究的多次實驗結果顯示該配比組成在發(fā)揮苯海拉明抗暈動癥作用的同時，咖啡因降低了嗜睡反應的發(fā)生率，效果比較理想。

圖1 鹽酸苯海拉明結構式[15]1 000

圖2 咖啡因結構式[15]649

1.1.2 CHL細胞及大鼠肝微粒體酶S9CHL細胞購自于上海中喬新舟生物科技有限公司。S9購自美國Moltox公司，批號4144；規(guī)格2 mL/支；有效期至2021年12月12日；-80℃保存。代謝活化系統是S9和輔助因子的混合物，臨用前新鮮配制。

1.1.3 動物SPF級ICR小鼠共60只，每組10只，雌雄各半，5～7周齡，雌鼠體質量21.7～25.1 g；雄鼠體質量23.5～26.8 g，源自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，實驗動物合格證號2018006019883。

1.2 試驗方法

按最新的《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》[16-17]的設計要求，分別應用Ames試驗[18]、體外培養(yǎng)CHL細胞染色體畸變試驗[19]和ICR小鼠骨髓微核試驗[20]檢測鹽酸苯海拉明咖啡因復方的遺傳毒性。檢測終點覆蓋了基因突變和染色體損傷。

1.2.1 Ames試驗組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5個菌株，均購自美國Moltox公司。所用菌株均已進行了R因子、組氨酸缺陷型等鑒定，結果表明本試驗所用的各種菌株基因型均合格。Ames試驗受試物的最高濃度主要取決于受試物對細菌的毒性和溶解度。對不受溶解度或細胞毒性限制的受試物，應達到的最高濃度為5 mg/皿[9]，故設鹽酸苯海拉明咖啡因復方總劑量為0.5、5、50、500、5 000 mg/皿共5個劑量組，此外設空白對照、溶媒對照和陽性對照組(見表1)，每皿均加入相應濃度的供試品溶液0.1 mL。采用標準平板摻入法，使細菌在加和不加S9(大鼠肝微粒體酶S9勻漿4 mL、0.2 mol/L pH=7.4的PBS 50 mL、MgCl2-KCl溶液2.0 mL、1 mol/L 6-磷酸葡萄糖溶液0.5 mL、0.1 mol/L NADP/輔酶Ⅱ4.0 mL、無菌去離水17.5 mL)的條件下接觸受試物，每皿均加入供試品、溶媒對照(超純水)或陽性對照物0.1 mL，加S9組在每個平皿的試驗體系中加入0.5 mL的S9混合液，不加S9組在每個平皿的試驗體系中加入0.5 mL的PBS。每個劑量組及對照組均平行設3個皿。采用最低極限(能使組氨酸缺陷型菌株長成菌落所需的最小濃度的組氨酸瓊脂平板)的組氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，先用顯微鏡觀察平皿上的菌苔生長情況，確定受試物無明顯的抑菌或殺菌作用，再人工計數每皿回復突變的菌落數，并計算每組的均值和標準差，與溶劑對照組進行比較。

表1 Ames試驗陽性對照品及其濃度(100μL/皿)

1.2.2 體外培養(yǎng)CHL細胞染色體畸變試驗染色體畸變預試驗最高濃度為0.5 mg/mL，溶解受限時，以受試物在溶媒中的最大溶解度為最高濃度，再按等比級數設計若干個濃度[9]。通過預試驗測定供試品鹽酸苯海拉明咖啡因復方的IC50。本次預試驗結果IC50為33.8 mg/mL。故在加和不加S9(S92.0 mL、HEPES 6.3 mg、MgCl2·6H2O 6.9 mg、KCl 16.4 mg、6-磷酸葡萄糖10.1 mg、70%NADP 27.3 mg、無菌去離子水4.6 mL)的條件下，體外培養(yǎng)的CHL細胞中加入相應濃度的低(8.45 mg/mL)、中(16.9 mg/mL)、高(33.8 mg/mL)劑量組供試品，反應體系總體積為6 mL。另設溶媒對照組、陽性對照組，每組均設2個平行樣品。陽性對照：-S9時用0.5 mg/mL絲裂霉素C，+S9時用60 mg/mL環(huán)磷酰胺。藥物作用分別于細胞4 h后棄去原培養(yǎng)基加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，或作用于細胞24 h后收集細胞。終止培養(yǎng)前4 h，加入20 mg/mL秋水仙堿60 mL，培養(yǎng)結束收集細胞，經離心、低滲處理后，再進行固定、離心、制片得細胞染色體玻片，鏡檢前用劉氏染液染色，每個劑量組制備2～4張玻片標本。

鏡檢時每組觀察300個分散良好并且數目完整的中期分裂相細胞染色體(若觀察到大量畸變染色體，如陽性對照組，分析染色體數可相應減少為100個)。分別記錄各組含有結構畸變染色體的細胞數和畸變類型(計數染色體或染色單體的斷裂、缺失及其他類型結構異常的數目)，裂隙單獨記錄，但不計入畸變率中。同時單獨記錄多倍體和核內復制等數目畸變，均不計入畸變率中。計算每組的染色體畸變率。

1.2.3 ICR小鼠骨髓微核試驗檢疫期結束后對小鼠稱量體質量并按隨機區(qū)組法分成6組，根據ICR小鼠單次給藥毒性試驗結果，供試品鹽酸苯海拉明咖啡因復方LD50為172.7 mg/kg。本次試驗以1/2 LD50為最高劑量，其他劑量按等比級數設置，分別為上一個劑量的1/2[9]。故 設 低(21.59 mg/kg)、中(43.17 mg/kg)、高(86.35 mg/kg)劑量組小鼠經口灌胃，其中高劑量組設兩組，分別在藥物作用24 h和48 h后處死，并設陽性對照(40 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔一次注射，給藥容量為10 mL/kg)和溶劑對照組(經口灌胃超純水)，給藥容積為15 mL/kg。除高劑量48 h組外，其他組均在藥物作用24 h后處死。取股骨制備骨髓涂片，每只小鼠制2張骨髓片，自然干燥后，取劉氏染液A液和B液，按2∶1混勻配制成應用液，均勻鋪于玻片表面，染色1～2 min后用清水沖洗掉玻片上的染色液，自然晾干。

每只動物鏡檢約4 000個骨髓嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocytes，PCE)，計數含微核的PCE數，計算微核發(fā)生率，同時至少計數500個骨髓紅細胞以確定嗜多染紅細胞(PCE)與正染紅細胞(normochromatic erythrocytes，NCE)的比例，評價受試物是否有骨髓毒性。

1.3 統計學方法

Ames試驗結果的評價是以比較給藥組與溶劑對照組的回復突變菌落數為基礎，若某劑量組回復突變菌落數為溶劑對照組的2倍以上，呈現可重復性，并在一定的劑量范圍內存在著劑量-反應關系，則判斷為陽性[11]；CHL細胞染色體畸變試驗和ICR小鼠骨髓微核試驗均采用卡方檢驗比較給藥組與溶媒對照組之間的差異是否具有統計學意義[12-13]。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Ames試驗結果

所有平皿經觀察均未見雜菌污染，并可見背景目標菌苔生長。5個菌株的自發(fā)回復突變菌落數以及陽性對照誘發(fā)的回復突變菌落數均在歷史對照范圍內，并且陽性對照組與空白對照組相比回復突變菌落數顯著增加，提示本試驗系統符合試驗要求。在受試物最高劑量達到5 000 mg/皿的受試條件下，未觀察到鹽酸苯海拉明咖啡因復方的抑菌現象。各劑量組受試物在加和不加S9時物種菌株所誘發(fā)的回復突變菌落數均與自發(fā)的突變菌落數相近，并且未觀察到明顯的劑量-反應關系。結果見表2。

表2 鹽酸苯海拉明咖啡因復方的Ames試驗回變菌落數(個/皿，±s)

表2 鹽酸苯海拉明咖啡因復方的Ames試驗回變菌落數(個/皿，±s)

組別受試物0.5 mg/皿5 mg/皿50 mg/皿500 mg/皿5 000 mg/皿空白對照組溶劑對照組陽性對照組TA97+S9 59±1 53±8 69±3 65±9 69±13 63±23 63±12 680±72-S9 64±6 57±3 58±7 60±5 59±11 60±9 56±6 630±48 TA98+S9 17±2 17±2 16±2 29±7 25±6 23±3 23±6 847±46-S9 16±2 14±2 18±2 23±4 26±3 25±9 19±3 1 019±162 TA100+S9 98±2 129±22 116±28 104±17 110±19 118±33 113±15 785±224-S9 93±13 107±3 113±12 94±24 115±12 119±9 115±17 854±54 TA102+S9 147±12 173±58 163±57 183±53 178±46 171±20 179±32 1 028±82-S9 172±41 190±56 194±23 159±37 179±22 171±36 197±28 970±32 TA1535+S9 17±2 12±4 11±2 9±3 12±4 18±1 21±5 453±30-S9 17±1 14±4 10±4 10±2 12±4 12±3 16±4 452±22

2.2 體外培養(yǎng)CHL細胞染色體畸變試驗結果

見表3。經顯微鏡觀察陽性對照組能夠誘發(fā)受試細胞染色體的畸變率顯著增高，與溶劑對照組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)；鹽酸苯海拉明咖啡因復方各劑量組的CHL細胞染色體畸變率與溶劑對照組相比差異均無統計學意義(P＞0.05)，結果為陰性。

表3 鹽酸苯海拉明咖啡因復方的體外培養(yǎng)CHL細胞染色體畸變試驗結果

2.3 ICR小鼠骨髓微核試驗結果

見表4。鹽酸苯海拉明咖啡因復方各劑量組小鼠在給藥后未見異常，且未出現動物死亡。鹽酸苯海拉明咖啡因復方不同劑量下雌、雄小鼠骨髓細胞中PCE/(PCE+NCE)＞50%，未觀察到對小鼠骨髓的抑制作用，各劑量組微核率與溶劑對照組相比差異均無統計學意義(P＞0.05)。提示鹽酸苯海拉明咖啡因復方小鼠骨髓微核試驗結果為陰性。

表4 鹽酸苯海拉明咖啡因復方的ICR小鼠骨髓微核試驗結果(n=5)

3 討論

本研究采用的是遺傳毒性研究經典的試驗組合，這3個試驗分別從體外到體內，從微生物、離體細胞和整體動物水平上評價藥物的遺傳毒性，是最新的《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》推薦的標準試驗組合[16-17]，體外試驗中包含了加與不加代謝活化系統，能檢測基因突變、染色體畸變等多個遺傳學終點，符合國際標準化的要求。隨著新型藥物的涌現以及對藥物評價試驗要求的不斷提高，傳統的試驗體系也歷經了一系列優(yōu)化[21]。近幾年受到普遍關注的流式細胞術檢測體外微核[22]、彗星試驗[23-24]，Pig-a基因突變試驗[25]，作為逐漸被認可的遺傳試驗方法，讓今后的遺傳毒性測試方法組合增加了更多選擇，使遺傳毒性評價體系更加完善。

我們分別查閱了苯海拉明和咖啡因遺傳毒性相關的文獻。苯海拉明和氫氯噻嗪對TA98菌株有致突變作用[26]；鹽酸苯海拉明在濃度達150或50 kg/mL時，未觀察到細胞周期的延遲，無論是否加入S9，均未誘發(fā)染色體畸變。在高劑量(300 pg/mL)下，加S9組的染色體畸變試驗在標準收獲期為陰性，但計數少于100個中期細胞可被忽略。在最高劑量(含和不含S9)下，在一個18 h的實驗中，產生染色單體斷裂、三輻體和四輻體；在一個16 h的化學暴露和6 h的恢復期的實驗中，X染色體上一個位點的染色體斷裂數對陽性反應有顯著影響[27]。苯海拉明急性毒性試驗結果顯示，經口小鼠LD50為160 mg/kg；腹腔內注射小鼠LD50為56 mg/kg；靜脈注射小鼠LD50為20 mg/kg[28]。與此同時，有報道咖啡因急性毒性試驗結果顯示，經口給藥時對小鼠、倉鼠、大鼠、兔的LD50分別為127、230、355、246 mg/kg(雄性)和137、249、247、224 mg/kg(雌性)[28]?？Х纫虻闹峦蛔儩摿σ言诘偷壬镏械玫阶C實，大多數關于其誘導染色體損傷的數據是在濃度約為咖啡過量者預期劑量6～100倍的情況下獲得的，并且通常比咖啡因對人體的估計致死劑量大幾個數量級[29]。因此，飲用適量到正常量的咖啡和咖啡因誘發(fā)人類突變效應的可能性幾乎是不存在的。有研究表明咖啡因及其衍生物和代謝物可在輻射引起的多種細胞和組織損傷中發(fā)揮抗氧化、化學預防和輻射防護作用，對化學誘導的癌變產生保護作用[30]。本次評價的藥物是一類復方制劑，主要利用咖啡因興奮作用與苯海拉明鎮(zhèn)定作用的互補，以彌補苯海拉明因嗜睡產生的不適感覺。將這兩種藥物以一定比例混合而得的復方制劑屬國內首創(chuàng)，且該類復方制劑的遺傳毒性研究此前未見報道。綜上所述，在本實驗條件下鹽酸苯海拉明咖啡因復方制劑的毒性小于單一樣品。本研究結果提示鹽酸苯海拉明咖啡因復方不具有遺傳毒性和潛在致癌性，與相關的文獻報道結論基本相符，本次研究對于其將來的應用及推廣具有參考意義。