劉香東，趙增琳，王鸞鸞，展榮凱，劉增祥，吳新宇，劉成虎

(山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院，山東濟(jì)南 250101)

慢性毒性與致癌合并試驗是將受試物長期反復(fù)給予試驗動物，觀察其對試驗動物的慢性毒性和致腫瘤作用，確定慢性毒性的最大無作用劑量和致癌的可能性。該試驗也是費時最長、參加人員最多、消耗財力和物質(zhì)最大、操作繁瑣復(fù)雜而又經(jīng)不起重復(fù)的高難度研究工作[1]。

我國2007年就發(fā)布了化妝品慢性毒性與致癌合并試驗的要求原則[2]。國家參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織化學(xué)品測試指南No.453-1981(致癌性研究)和No.451-2009(慢性毒性/致癌性結(jié)合研究)，編制出版了化學(xué)品、食品、農(nóng)藥等慢性毒性和致癌合并試驗國家標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。國內(nèi)也陸續(xù)發(fā)表了一些慢性毒性與致癌性試驗的研究，通過慢性毒性與致癌合并試驗了解了部分藥物的慢性毒性和致腫瘤作用[6]。目前，醫(yī)療器械領(lǐng)域還沒有建立慢性毒性與致癌合并試驗國家標(biāo)準(zhǔn)，這使得醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)在需要做慢性毒性與致癌合并試驗時無標(biāo)準(zhǔn)可循。因此，建立醫(yī)療器械領(lǐng)域慢性毒性與致癌合并試驗國家標(biāo)準(zhǔn)刻不容緩。

已經(jīng)發(fā)布的各行業(yè)慢性毒性與致癌合并試驗標(biāo)準(zhǔn)要求在試驗第3、6、12和第18個月對動物進(jìn)行臨床病理檢測，且建議每個時段取血為同一只大鼠。但是，初步研究發(fā)現(xiàn)分時段取血易導(dǎo)致動物出現(xiàn)一定的死亡率，大大降低動物存活率，并且取血量無法滿足臨床病理檢測要求。

鎂合金材料密度小、比強度高，具有優(yōu)異的力學(xué)性能、良好生物相容性和可降解性，近年來成為可降解生物醫(yī)用材料的研究熱點[7-8]。目前鎂合金材料作為醫(yī)用材料大多還處于研究階段，其轉(zhuǎn)化為臨床產(chǎn)品仍需要大量的體內(nèi)外安全評價數(shù)據(jù)[9]。鎂合金材料制成的接骨板需要長期植入人體，這就需要考慮其對人體的慢性毒性作用和致腫瘤作用，即慢性毒性與致癌合并試驗。

因此本文將鎂合金材料——接骨板植入到大鼠皮下，進(jìn)行長達(dá)18個月的慢性毒性研究，以期為鎂合金材料在臨床應(yīng)用以及慢性毒性與致癌合并試驗是否需要分時段取血提供參考。同時為建立醫(yī)療器械領(lǐng)域慢性毒性與致癌合并試驗國家標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備本研究使用的主要儀器包括：日立全自動生化分析儀(7180型，日立株式會社日立高新技術(shù))；全自動血液分析儀(XN-1000)和全自動凝血分析儀(CA-7000)均購自希森美康株式會社)；高速冷凍離心機(jī)(Multifuge X3，賽默飛世爾科技有限公司)。

1.1.2 試驗動物與動物管理SD(Sprague-Dawley)大鼠160只，SPF級，雌雄各半，6～9周齡，體質(zhì)量160～180 g，由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006，已通過山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院實驗動物倫理委員會倫理審查(R20190411)。

1.1.3 試驗樣品可降解鎂合金顱頜面內(nèi)固定系統(tǒng)(接骨板)，型號/規(guī)格為?16×21 mm，批號19032601，材料為Jokia BM ZG20。

1.1.4 試劑血清生化檢測試劑盒(日本和光純藥工業(yè)株式會社)；血清生化多項質(zhì)控品(美國貝克曼庫爾特有限公司，規(guī)格5 mL)；凝血測定試劑盒及凝血質(zhì)控品(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH，凝血質(zhì)控品，規(guī)格1 mL)；血常規(guī)指標(biāo)檢測試劑[希森美康生物科技(無錫)有限公司]；血常規(guī)指標(biāo)檢測試劑質(zhì)控品(SYSMEX，規(guī)格3.0 mL)；戊巴比妥鈉(Ruitaibio，規(guī)格25 g)。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組選取SD大鼠240只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為試驗組和對照組。試驗組和對照組均設(shè)置4組，即分別為植入3、6、12和18個月。各組每種性別各15只大鼠。每種性別動物的體質(zhì)量差異不超過平均體質(zhì)量的20%。

1.2.2 植入劑量設(shè)計鎂合金材料人體擬用臨床最高劑量為4.5 g，假設(shè)人平均體質(zhì)量60 kg，按50倍量進(jìn)行大鼠實驗，即植入劑量為3.75 g/kg。一只大鼠實際植入量為0.75 g(大鼠體質(zhì)量按0.2 kg計)。根據(jù)鎂合金密度，本次試驗選取半徑0.8 cm，厚度0.21 cm的圓片作為植入物，每只大鼠植入1個圓片。

1.2.3 皮下植入按照40 mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉動物，用電推剪將動物背部手術(shù)區(qū)的被毛除掉，將制備好的鎂合金材料植入試驗組大鼠背部皮下組織中。對照組動物做假手術(shù)處理。

1.2.4 臨床病理學(xué)檢查植入第3、6、12和第18個月。試驗組和對照組，每組檢查雌雄各10只動物。檢測指標(biāo)及對應(yīng)英文縮寫見表1。

表1 臨床病理檢測指標(biāo)及對應(yīng)英文縮寫

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以±s表示，對動物各時段血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)進(jìn)行獨立樣本t檢驗，如果P＜0.05則認(rèn)為兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鎂合金材料對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

在植入后第6個月時，試驗組雌性大鼠RBC顯著性低于對照組雌性大鼠(P＜0.05)，試驗組雄性大鼠PT顯著性高于對照組雄性大鼠(P＜0.01)；在第18個月時，試驗組雄性大鼠MONO顯著高于對照組雄性大鼠(P＜0.05)。在4個時間段內(nèi)，其它血液學(xué)指標(biāo)兩個組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表2。

2.2 鎂合金材料對大鼠血生化指標(biāo)的影響

在第6個月時，試驗組雌性大鼠TBIL低于對照組雌性大鼠(P＜0.05)，試驗組雄性大鼠Ca2+濃度高于對照組雄性大鼠(P＜0.05)。在第18個月時，試驗組雌性大鼠TG高于對照組雌性大鼠(P＜0.05)。在4個時間段內(nèi)，大鼠其它血生化指標(biāo)兩個組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表3。

3 討論

不同時間段取血檢測比較，發(fā)現(xiàn)4個時間段內(nèi)的試驗組和對照組相比，血液學(xué)指標(biāo)中RBC、PT、MONO有顯著差異，血生化指標(biāo)TBIL、Ca2+、TG存在顯著差異。RBC病理性降低可見于各種貧血等，PT延長可見于纖維蛋白原缺乏等，MONO病理性升高可見于某些感染等。TBIL降低無明顯的臨床義，TG和Ca2+病理性升高可見于腎臟損傷等。雖然血液學(xué)、血生化檢查中個別指標(biāo)有些差別，但波動均在本實驗正常參考范圍，臨床觀察顯示試驗動物無相關(guān)疾病或損傷表現(xiàn)，差異僅出現(xiàn)在單個性別組，未體現(xiàn)毒性特征，所以差異非病理性變化，僅體現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義。

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，SD大鼠在第12個月后，對照組和試驗組動物均出現(xiàn)大量自發(fā)性腫瘤。因此，第18個月的臨床數(shù)據(jù)，由于大鼠不同程度的自發(fā)腫瘤發(fā)生，導(dǎo)致臨床病理指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差偏大，但未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。

在一定的時間內(nèi)，采血量和采血次數(shù)的增加，會引起大鼠一定的應(yīng)激性反應(yīng)或采血部位的傷害[10]。多次采血方式一般選取眼眶后靜脈采血，頸靜脈采血，心臟穿刺采血等，這些采血方式成功率未達(dá)到100%。狀況良好的大鼠一般采血量建議不超過循環(huán)血量的10%，即大鼠每次最大采血量為1.6 mL[11]。取血量較少，無法同時滿足臨床病理檢測。且后期由于大鼠自發(fā)腫瘤發(fā)生，對大鼠的生活造成一定的影響，此時再進(jìn)行取血，極易造成動物死亡，無法判斷大鼠提前死亡原因，對判斷腫瘤發(fā)生時間產(chǎn)生干擾。

多次采血可能會與藥物的毒性作用產(chǎn)生一定的疊加效應(yīng)，因此設(shè)置衛(wèi)星組動物采血比較合適[12]。通過文獻(xiàn)搜索，大部分選擇與本文同樣的條件，即增加衛(wèi)星組來滿足慢性毒性與致癌合并試驗中的各時段采血要求[13-14]。也有部分只是在文中籠統(tǒng)說按照標(biāo)準(zhǔn)分時段取血，未明確是否為同一只大鼠[15]。即使明確同一只大鼠，在文中的相關(guān)數(shù)據(jù)很少[16]。也有相關(guān)文獻(xiàn)在報道慢性毒性與致癌合并試驗結(jié)果時直接明確未分時段取血[17]。

本次實驗結(jié)果提示，為保證動物的存活率，在建立醫(yī)療器械慢性毒性與致癌合并試驗國家標(biāo)準(zhǔn)中或者在進(jìn)行醫(yī)療器械/生物材料慢性毒性與致癌合并試驗時，對鎂合金材料(接骨板)取消分時段取血是可行的。同時我們建議增加臨床觀察頻率，使瀕死動物能及時取血、解剖，以便確定死亡原因，從而更好的分析醫(yī)療器械材料對大鼠的慢性毒性作用以及致癌作用。