韋秋恩 李志瑛 張大鵬 石鵬 孫熹微 肖勇 王永

摘要植物種質(zhì)資源是遺傳育種的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源保存技術(shù)研究與應(yīng)用對(duì)維持物種多樣性具有重要意義。超低溫保存具有保存時(shí)間長、節(jié)約空間等優(yōu)點(diǎn)，是一種重要的植物離體保存技術(shù)。對(duì)熱帶作物組織器官超低溫保存技術(shù)的意義、原理、方法以及復(fù)蘇檢測(cè)等進(jìn)行了歸納總結(jié)，可為熱帶作物種質(zhì)資源離體保存以及生物育種的拓展應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞種質(zhì)資源;熱帶作物;超低溫保存;解凍復(fù)蘇

中圖分類號(hào) S682.31??????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A???????? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.009

Research Progress in Cryopreservation， Thaw and Recovery of Tissues and Organs of Tropical Crops

WEI Qiu’en1??? LI Zhiying2，3??? ZHANG Dapeng2，3??? SHI Peng2，3??? SUN Xiwei2，3 XIAO Yong2，3??? WANG Yong2，3

（1. College ofHorticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China;2. Coconut Research Institute， Chinese Academy ofTropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China;3. Sanya Research Institute of Chinese Academy of TropicalAgricultural Sciences， Sanya， Hainan 572000， China）

Abstract?? Plant germplasm resources are the basis of genetics and breeding， and their conservation is very important for maintaining plant species diversity. Cryopreservation is one of the important in vitro conservation methods and has many ad- vantages， such as long-term storage and little storage space. The significance， principles， method， recovery and detection of cryopreservation of tissues and organs of tropical crops are reviewed， which can provide reference for the in vitro conservation of germplasm resources of tropical crops and their use for biological breeding.

Keywords?? germplasm resource; tropical crop; cryopreservation; thaw for recovery

植物種質(zhì)資源是種業(yè)原始創(chuàng)新、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，是保障國家糧食安全、生態(tài)安全和能源安全的戰(zhàn)略性資源[1]。在20世紀(jì)中葉，世界各國就已開始植物種質(zhì)資源的收集和保存工作。聯(lián)合國糧農(nóng)組織支持和協(xié)調(diào)國家與地區(qū)的遺傳資源調(diào)查、保存和利用，負(fù)責(zé)咨詢有關(guān)提案和設(shè)計(jì)，利用有限資金保存作物種質(zhì)資源[2]。中國20世紀(jì)50年代起開展了2 次全國性作物種質(zhì)資源征集，搶救收集了40萬份種質(zhì)資源，但由于缺乏現(xiàn)代化低溫庫保存設(shè)施，約有10萬份資源尚未完成搶救保存任務(wù)[3]，且目前需要保護(hù)的種質(zhì)資源逐年增加[4]。中國植物種質(zhì)資源豐富，有三萬多種高等植物，特有程度高，是生物區(qū)系起源中心之一。在過去的300年中，中國物種滅絕速度被人為地提高了1 000 多倍，物種流失態(tài)勢(shì)不容樂觀，大部分栽培作物原產(chǎn)地的野生資源及其近緣種都瀕臨滅絕[5]。種質(zhì)資源儲(chǔ)藏安全性的需求日益提高，因此，收集和保存種質(zhì)資源需引起全世界的重視。超低溫保存是一種植物種質(zhì)資源長期安全保存的方法，植物材料可長期保持形態(tài)發(fā)育的潛能和維持遺傳性狀穩(wěn)定[6]。與傳統(tǒng)的原位保存相比，超低溫保存既可以節(jié)省大量的土地資源，又可減少對(duì)外界環(huán)境的破壞，具有很強(qiáng)的保存穩(wěn)定性[7]。中國熱帶面積為50萬 m2，約占國土面積的 5%，具有獨(dú)特的生物多樣性和分布地域的不可替代性，是中國生物多樣性的重要組成部分[8]。特色熱帶作物種質(zhì)資源保存體系尚未健全，建立熱帶作物種質(zhì)資源的超低溫先進(jìn)保存技術(shù)尤為重要。

1? 植物超低溫保存的應(yīng)用與意義

超低溫保存是目前植物種質(zhì)資源長期穩(wěn)定保存的常用方法之一。在液氮條件下，活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動(dòng)幾乎完全停止，植物體處于一種相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)[9]。超低溫保存處理時(shí)間短，愈傷組織可以在液氮中長期保存，除需定期補(bǔ)充一些液氮，不需要其它儀器和機(jī)械設(shè)備，可節(jié)省大量的人力物力，保存成本相對(duì)較低。超低溫保存相當(dāng)于一個(gè)低溫逆境淘汰的過程，經(jīng)過超低溫保存后復(fù)蘇再生的愈傷組織抗逆性強(qiáng)，生命力旺盛[10]，可以大大減少甚至終止被保存材料的代謝衰老過程，保持生物材料的穩(wěn)定性，最大限度地抑制生理代謝強(qiáng)度，達(dá)到長期保存種質(zhì)的目的[9]。研究表明，低溫保存可維持凍存材料的遺傳穩(wěn)定性[11]，以凍存后復(fù)蘇的香蕉胚性細(xì)胞懸浮系為材料，對(duì)經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑獲得的再生植株遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，再生植株與對(duì)照在形態(tài)學(xué)方面無明顯區(qū)別，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間（ ISSR ）分子標(biāo)記鑒定也未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

有些作物存在自繁帶毒的問題，從而影響經(jīng)濟(jì)效益，因此脫毒育苗對(duì)于相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。超低溫脫毒技術(shù)是一種基于超低溫保存技術(shù)的高效脫毒技術(shù)[12]。Helliot等[13]用低溫療法成功地去除了香蕉條斑病毒（ BSV ），脫毒率為90%。該方法被廣泛應(yīng)用于柑橘、番木瓜、香蕉等[14]多種經(jīng)濟(jì)作物。并取得了滿意的脫毒效果。

2? 超低溫保存原理

生物體的新陳代謝速度常隨著溫度的下降而減緩。溫度下降至?196℃時(shí)，細(xì)胞的生長和酶的代謝活動(dòng)接近停止，但可保存細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能，因而遺傳穩(wěn)定性得以保存，當(dāng)恢復(fù)至合適條件時(shí)細(xì)胞能夠恢復(fù)正常狀態(tài)下的生理功能[15]。新鮮的植物細(xì)胞預(yù)處理后，在冷凍保護(hù)劑的作用下發(fā)生質(zhì)壁分離;細(xì)胞外介質(zhì)結(jié)冰，細(xì)胞內(nèi)尚未結(jié)冰，胞外冰晶不斷增加，在蒸氣壓差作用下，細(xì)胞失水并逐漸變?yōu)槊撍疇顟B(tài)，此種狀態(tài)能有效阻止細(xì)胞質(zhì)和液泡結(jié)冰，當(dāng)細(xì)胞和保護(hù)劑間蒸氣壓達(dá)到平衡時(shí)，將材料置于液氮，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)玻璃化，且胞內(nèi)水分子不發(fā)生重組，不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積變化，這種玻璃態(tài)的水對(duì)細(xì)胞不構(gòu)成直接傷害，可保證超低溫保存后的細(xì)胞活力[16-17]。超低溫凍存過程中，對(duì)細(xì)胞損傷最大的是胞內(nèi)形成冰晶，因此，應(yīng)盡量避免胞內(nèi)冰晶的形成。

3? 保存流程

超低溫保存的基本過程包括：組織材料的選擇→預(yù)處理→降溫保存→解凍復(fù)蘇→存活鑒定。比較常用的方法有快凍法、玻璃化法、包埋干燥法等[18]。由于外植體材料的類型、含水量、耐脫水程度及抗凍能力的不同，選擇最適的超低溫保存方法，是提高超低溫保存后遺傳材料存活率的關(guān)鍵[19]。

3.1? 保存材料的選擇

植物材料的基因型不同，超低溫保存后存活率一般會(huì)存在差異，同時(shí)材料的生理狀態(tài)也會(huì)影響超低溫保存后的效果[3]。一般來說，超低溫保存技術(shù)需要選擇遺傳穩(wěn)定、再生能力強(qiáng)且成活率較高的材料[5，20]。常見的有種子、花粉、合子胚、莖尖、愈傷組織等?；ǚ郾４娉Ｓ糜诓煌ㄆ谄贩N的異花授粉，其目的是促進(jìn)計(jì)劃育種的雜交，可以在不同地點(diǎn)之間分配和交換種質(zhì)，以保存種質(zhì)的核心基因;同時(shí)，還可用于基因表達(dá)、轉(zhuǎn)化和體外受精的技術(shù)研究[21]。莖尖分生組織的分化程度小，在超低溫保存后的再生過程中，比其他細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳性穩(wěn)定，是超低溫保存的一種理想材料，具有獨(dú)特的優(yōu)越性。尤其對(duì)那些易產(chǎn)生體細(xì)胞無性系變異或營養(yǎng)繁殖的植物來說，莖尖分生組織超低溫保存是比較理想的保存方案[22]。Ahmore等[23]用番木瓜莖尖進(jìn)行冷凍保存后，番木瓜基因型的再生率為70%。Abdelnour等[24]對(duì)二倍體 AA、BB 型香蕉的合子胚進(jìn)行了超低溫保存，解凍后 AA 、BB 型的存活率分別達(dá)到80%、 92%。

3.2? 預(yù)處理

高滲培養(yǎng)、蔗糖培養(yǎng)、低溫培養(yǎng)、 ABA 培養(yǎng)等預(yù)處理都可以提高植物對(duì)超低溫的耐性。高滲培養(yǎng)可通過提高培養(yǎng)基中糖的濃度，添加甘露醇、山梨醇、脫落酸、脯氨酸、二甲基亞砜（ DMSO ）等物質(zhì)引起細(xì)胞脫水[25]，提高分裂相細(xì)胞的比例，減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量[26]。增加組織中可溶性糖等保護(hù)性物質(zhì)的含量，可避免由于自由水含量高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成大冰晶，使細(xì)胞受損[27]。離體材料的適當(dāng)脫水對(duì)提高超低溫保存材料的復(fù)蘇成活率有顯著影響[28]。在大多數(shù)情況下，將種子水分含量降低到5%～10%就足以抵抗超低溫[29]。在預(yù)處理中糖濃度的使用頗為重要，它可被視為玻璃化劑，也可用作防凍劑。適當(dāng)提高糖含量可以有效地降低滲透勢(shì)，導(dǎo)致水分含量降低，因此糖可以直接發(fā)揮脫水或冷凍耐受性的作用，且在細(xì)胞中累積不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害作用[30]。將椰棗在 0.5 mol/L 蔗糖培養(yǎng)基中預(yù)處理48 h 后，使用冷凍劑處理再解凍，再生率為40%[31]。預(yù)處理時(shí)間與存活率有關(guān)，當(dāng)蔗糖濃度為0.7 mol/L 時(shí)，并且將香蕉胚性細(xì)胞預(yù)處理時(shí)間控制在2 d 時(shí)，保存效果最好，存活率為76.14%;而隨著預(yù)處理時(shí)間的延長，存活率迅速下降[32]。椰子合子胚在1.75 mol/L 蔗糖預(yù)處理下，存活率和發(fā)芽率分別為 82%和79%[33]。Hu 等[34]將菠蘿莖尖用含有2.0 mol/L 甘油和0.4 mol/L 蔗糖的培養(yǎng)基在25℃下預(yù)處理60 min，存活率為100%。用含0.6 mol/L 蔗糖的 MS 培養(yǎng)基預(yù)處理山竹莖尖2 d，存活率僅為（13.7±5.5）%[35]。由此可見，根據(jù)不同的植物材料的特性，選擇合適的預(yù)處理方式，使植物材料達(dá)到超低溫保存的理想生理狀態(tài)，是提高恢復(fù)再生率的有效途徑。

3.3? 冷凍保護(hù)劑的選擇

冷凍保護(hù)劑能減少超低溫保存造成的傷害[36]。因此，選好冷凍保護(hù)劑是超低溫處理成功的關(guān)鍵。冷凍保護(hù)劑具有溶于水、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，能增加膜透性，加速細(xì)胞內(nèi)的水分外滲，保護(hù)組織免受冷凍傷害[37]。目前常采用滲透性物質(zhì)或非滲透性物質(zhì)的冷凍保護(hù)劑，滲透物質(zhì)包括甘油、乙二醇、二甲基亞砜（ DMSO ）等，非滲透性物質(zhì)包括蔗糖、甘露醇、聚乙二醇等[38]。添加脯氨酸作為抗氧化劑也能夠起到穩(wěn)定凍存細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，復(fù)合冷凍劑能充分發(fā)揮各種成分的保護(hù)作用，從而產(chǎn)生累加作用，但其毒性不累加[38]。用魚類抗凍蛋白作為超低溫保存的保護(hù)劑，提高了細(xì)胞的成活率，但目前抗凍蛋白基本上都是從極地魚類提取，價(jià)格昂貴，僅適宜于研究和專門的應(yīng)用，暫時(shí)還無法普及[39]。

一般認(rèn)為， DMSO 是最有效的冷凍保護(hù)劑之一。 DMSO 可迅速滲透細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞液冰點(diǎn)溫度，且易透入細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞在凍融時(shí)不會(huì)因強(qiáng)烈脫水而損傷[40]。在凍存時(shí)處理不同材料所用的 DMSO 濃度不同。在常溫下 DMSO 對(duì)細(xì)胞有輕度藥害，但隨著溫度的降低，藥害作用也隨之減小[41]。在0℃處理?xiàng)l件下可減輕冷凍保護(hù)劑對(duì)材料的毒害[42-43]。

PVS2（ MS+30%甘油+15%乙二醇 +15% DMSO+0.4 mol/L 蔗糖）被認(rèn)為是目前最常用、效果最好的冰凍保護(hù)劑，在部分植物中廣泛應(yīng)用。使用玻璃化溶液 PVS2 在0℃處理香蕉莖尖30 min，可以防止細(xì)胞質(zhì)中冰晶的形成[44]，未經(jīng) PVS2 處理的材料，保存后莖尖死亡;經(jīng)30～ 40 min 處理的材料，成活率顯著提高，最高達(dá) 75.9%;但隨處理時(shí)間的延長，成活率又迅速下降，其主要原因是 PVS2中 DMSO 的毒害和過度脫水對(duì)材料的傷害[45]。不同濃度 PVS2及時(shí)間處理的材料獲得的成活率差異顯著。使用25% PVS2對(duì)預(yù)培養(yǎng)的香蕉胚性細(xì)胞懸浮系進(jìn)行過渡處理，隨著過渡處理時(shí)間的延長，細(xì)胞相對(duì)成活率逐漸提高，處理20 min 時(shí)達(dá)到最高;不經(jīng)過渡處理，直接用100% PVS2處理，胚性細(xì)胞懸浮系成活率僅為6.3%[11]。Takagi 等[28]比較了幾種熱帶植物對(duì) PVS2的反應(yīng)，在室溫下 PVS2處理10 min 后，所有的香蕉分生組織被殺死。相同材料不同組織對(duì)冷凍保護(hù)劑的耐受力不同。吳黎明等[45]以廣東粉蕉1 號(hào)莖尖為材料，結(jié)果表明，使用 PVS2處理香蕉莖尖，超低溫保存后效果好，而用 PVS3 （ MS+50%甘油+50%蔗糖）處理成活率為0。

冷凍保護(hù)劑除了起到保護(hù)材料的作用，還可起到提高材料抗耐性的作用。番木瓜莖尖超低溫保存過程中，細(xì)胞經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、60%? PVS （ MS+22%甘油+13%乙二醇+15% DMSO+13%聚乙二醇）預(yù)處理和 PVS 脫水處理后，細(xì)胞質(zhì)壁分離程度逐漸加重，細(xì)胞的抗凍力增加[46]。但也有報(bào)道認(rèn)為， PVS3是較好的冷凍保護(hù)劑。Sajini等[47]測(cè)試了7 種冷凍保護(hù)劑的效果，認(rèn)為 PVS3對(duì)冷凍椰子合子胚的萌發(fā)最有效，與 Cueto 等[33]研究結(jié)果一致。處理時(shí)間不同，存活率也不同，用 PVS3溶液對(duì)芒果胚性愈傷脫水處理30 min 時(shí)，存活率可達(dá)到96.7%;處理時(shí)間5? min 時(shí)，存活率約為80%[48]。由此可見，源于不同物種或不同部位的保存材料所使用的冷凍保護(hù)劑不盡相同。

3.4? 超低溫保存方法

植物材料經(jīng)過冷凍保護(hù)劑處理后，需冷凍在液氮中保存。材料凍害主要發(fā)生在冷凍過程中，為了減少凍害，提高存活率，必須盡量阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，使細(xì)胞進(jìn)入玻璃化狀態(tài)[49]。因此降溫方法是影響超低溫保存效果的關(guān)鍵因素之一[26]。目前使用的液氮超低溫保存方法主要有快凍法、兩步冷凍法、玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法等。不同的冷凍方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但目前還沒有一種方法可適用于所有植物種類和材料，必須根據(jù)不同植物材料來確定冷凍方法[50]。

3.4.1? 快凍法快凍法是將材料從0℃或其它預(yù)處理溫度中直接投入液氮內(nèi)[51]。其原理是利用超速冷凍，促使細(xì)胞內(nèi)的水分迅速從冰晶生成的危險(xiǎn)溫度區(qū)（? 140～10℃）降至?196℃的安全區(qū)，使細(xì)胞內(nèi)的水分來不及形成冰晶中心;此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的水分呈玻璃化狀態(tài)[36]，該狀態(tài)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生破壞作用，從而減輕或避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰危害[52]。此方法一般適用于一些高度脫水的植物材料，如種子、花粉、球莖等。黃皮新鮮花粉經(jīng)28℃干燥處理5～6 h 后，直接投入液氮，解凍后的花粉生活力最高，初步認(rèn)為黃皮花粉可以在液氮中長期貯存而不顯著失去生活力[53]。Panis 等[54]首次用快凍法保存香蕉莖尖分生組織并獲得成功，在保存的36個(gè)品種中， ABB 基因型香蕉的再生率最高，為 53%，其余基因組型再生率為3.9%～20%?？焖倮鋬龇ú僮鞅容^簡(jiǎn)單便捷，但再生率相對(duì)較低，不是保存作物種質(zhì)的最佳選擇。

3.4.2? 兩步冷凍法兩步冷凍法結(jié)合了慢凍和快凍，先用較慢的速度使材料降至某一溫度，用不同濃度的冷凍保護(hù)劑處理后，在 24～26℃或4℃下培養(yǎng)1? h，使細(xì)胞脫水;然后將細(xì)胞冷卻到?40～?25℃的中低溫，在此期間細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)劑促進(jìn)冷凍保護(hù)劑凍結(jié)而不形成冰晶;達(dá)到中間溫度后，將材料放入液氮進(jìn)行深度冷凍，以免因細(xì)胞外產(chǎn)生非均勻冰晶而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重傷害[44]。1990年， Panis 等[55]利用兩步冷凍法保存香蕉胚性懸浮細(xì)胞，在 0℃條件下先將懸浮細(xì)胞用7.5% DMSO 冰凍保護(hù)劑預(yù)處理1 h，然后以1℃/min 的慢凍速度降溫到?40℃，再投入液氮中冷凍保存，待香蕉胚性懸浮細(xì)胞解凍恢復(fù)生長后，經(jīng)誘導(dǎo)獲得再生植株。2009年，趙平娟等[10]研究表明，將橡膠胚性愈傷組織經(jīng)過?80℃緩慢降溫后再放入液氮中快速降溫進(jìn)行保存，容易恢復(fù)愈傷組織增殖能力。3.4.3? 玻璃化法 1973年，Luyet等[56]提出玻璃化法。1990年， Sakai 等[57]建立了超低溫玻璃化冷凍法，并保存臍橙核心（nucellarcell）細(xì)胞，存活率為80%。該法原理是，植物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護(hù)液處理后，快速投入液氮中保存，使得保護(hù)劑和細(xì)胞內(nèi)水分來不及形成冰晶，從而進(jìn)入完全玻璃化狀態(tài)[58]。目前玻璃化凍存法采取完全玻璃化法，即胞內(nèi)胞外同時(shí)為玻璃化狀態(tài)，可在解凍時(shí)均勻化凍。采用該方法對(duì)芒果胚性愈傷組織進(jìn)行保存，化凍后再培養(yǎng)的存活率可高達(dá) 100%[37];對(duì)香蕉離體莖尖進(jìn)行保存，平均再生率可達(dá)到69%[59];對(duì)巴西蕉莖尖進(jìn)行保存，成活率高達(dá)75.9%，再生率為63.4%[60]。傅翠娜[61]建立的菠蘿莖尖玻璃化法超低溫保存體系，最高可獲得96.2%的成活率和93.3%的芽再生率;保存后的莖尖經(jīng)誘導(dǎo)萌發(fā)，其形態(tài)上與對(duì)照一致，生根后可移栽成活。曾繼吾等[62]成功對(duì)番木瓜莖尖進(jìn)行了超低溫保存，成活率和再生率分別為53.3% 和51.6%。Suranthran等[63]冷凍保存的油棕多胚狀體（polyembryoids）存活率為45%。Gonzalez- Arnao等[64]冷凍了8 個(gè)菠蘿品種試管苗的莖尖，成活率為10%～65%。與傳統(tǒng)超低溫法相比，玻璃化法無需昂貴儀器，操作程序簡(jiǎn)單方便，在植物種質(zhì)的超低溫保存研究中得到了廣泛的應(yīng)用[65]。 3.4.4? 包埋干燥法 1990年， Fabre 等[66]首次利用超低溫包埋干燥法保存馬鈴薯莖尖。有研究認(rèn)為，包埋干燥法可以增強(qiáng)材料對(duì)干燥脫水和驟冷的抗性，有利于保存含水量較高的材料[67]。包埋干燥法步驟如下：（ 1）將材料接種于高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中脫水;（ 2）無菌空氣流或干燥硅膠二次脫水;（3 ）材料嵌入海藻酸鹽基質(zhì)中形成珠子;（ 4）液氮貯存;（ 5）置于水浴中解凍;（ 5）培養(yǎng)再生[68]。Rengeswaari等[69]采用包埋干燥法對(duì)油棕多胚狀體進(jìn)行保存，存活率最高為73.3%。N'Nan等[70]用此方法處理保存的椰子胚芽，存活率為60%。2012年，N'Nan等[71]研究出1 種保存椰子合子胚的簡(jiǎn)易方法，將合子胚接種于含3.2 mol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基后，置于含有80 或160 g 硅膠的密封容器中48或 24 h，冷凍保存的胚發(fā)芽率為13.7%～74%?？梢员苊庥卸颈Ｗo(hù)劑對(duì)材料造成損壞，可應(yīng)用于對(duì)低溫保護(hù)劑敏感的植物。此外，包埋干燥法相對(duì)于其他保存方法有著操作便捷、樣本量小、試驗(yàn)成本低等優(yōu)勢(shì)，但也存在如脫水需要時(shí)間較長、流程較長、容易污染等仍需改進(jìn)的問題[20]。

3.4.5? 包埋玻璃化法包埋玻璃化法是將植物細(xì)胞嵌入藻酸鹽基質(zhì)中，可以緩解冷凍和解凍過程中的機(jī)械應(yīng)力和滲透壓變化。首先植物細(xì)胞懸浮在含有2%海藻酸鈉的培養(yǎng)基中，然后滴加到0.1 mol/L? CaCl2 的溶液中，后者誘導(dǎo)交聯(lián)的海藻酸單體通過靜電相互作用，形成海藻酸珠;解凍后，海藻酸珠在培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾天后破碎并釋放細(xì)胞[44]。該方法具有能同時(shí)處理大量材料、處理后恢復(fù)生長快、對(duì)材料的毒害作用較小及成芽率高等優(yōu)點(diǎn)[72-73]。Gamez等[74]對(duì)菠蘿莖尖的包埋玻璃化法超低溫保存處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，將莖尖包埋在30 g/L 海藻酸鈣中，然后用0.16 mol/L 蔗糖+0.3 mol/L 脯氨酸和0.3 mol/L 蔗糖+0.3 mol/L 脯氨酸分別預(yù)處理2 d 和24 h，室溫下用0.75 mol/L 蔗糖+1 mol/L 甘油的裝載液處理25 min，0℃下用 PVS3 脫水60 min 后冷凍保存，品種 MD-2 和Puer-torico的莖尖存活率分別為54%和83%。陳志林等 [72]將木薯莖尖用含有2 mol/L 甘油和0.4 mol/L 蔗糖的裝載液處理30～40 min，然后置于含有0.5 mol/L 蔗糖的改良 MS 培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2 d，0℃下用 PVS2處理4 h，之后快速投入液氮中1 h，取出，放在40℃水浴鍋中化凍90 min，用含有1.2 mol/L 蔗糖的 MS 培養(yǎng)液洗滌20 min，接種于恢復(fù)培養(yǎng)基中，最高成活率接近70%，再生植株生長和分化正常。該方法同時(shí)具備了包埋干燥法與玻璃化法的優(yōu)點(diǎn)，如操作易掌握、材料恢復(fù)生長快等。

3.5? 解凍復(fù)蘇

超低溫保存對(duì)植物材料產(chǎn)生的傷害往往發(fā)生在冷凍和解凍這2 個(gè)急速變溫的過程中，因此不僅要在降溫冷凍過程中選擇最合適的方式，而且還要選擇合適的解凍方式[50]。處于液氮中的材料若慢慢升溫，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰和化凍吸水，對(duì)組織細(xì)胞造成二次傷害。因此應(yīng)該在嚴(yán)格控制溫度的條件下進(jìn)行化凍，一般采用37～40℃溫水浴解凍[19]。除干凍處理的保存材料外，化凍之后的材料還需要用洗滌液沖洗，減少恢復(fù)培養(yǎng)過程中殘留冷凍保護(hù)劑的毒害作用[75]。Sajini等[47]對(duì)椰子合子胚化凍過程中，將凍存管置于40℃條件下水浴解凍2 min ，直到 PVS3 溶解，再用含1.2 mol/L 蔗糖的 Y3液體培養(yǎng)基洗滌1.5 h，共洗滌 3次，復(fù)蘇培養(yǎng)后，存活率為70%～80%?；裘罹闧76]對(duì)貢蕉懸浮細(xì)胞進(jìn)行液氮保存，經(jīng) 37℃水浴解凍，用含有1.2 mol/L 蔗糖的洗滌液洗滌3 次，每次10 min，細(xì)胞生活力最高可達(dá)80.46%，后轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得了再生植株。 Ibrahim 等[35]以 MS+0.4 mol/L 蔗糖+2 mol/L 甘油作為洗滌液，山竹莖尖存活率為（ 44.1±6.5）%。

減少再培養(yǎng)中的光抑制有利于離體材料恢復(fù)生長。凍存的材料一般需在黑暗或弱光下培養(yǎng)2 周后，再轉(zhuǎn)入正常光照下培養(yǎng)[77]。再培養(yǎng)的培養(yǎng)基有時(shí)需將大量元素、瓊脂減半或添加 PVP、水解酪蛋白等成分以利于材料的生長恢復(fù)[78]。

3.6? 存活率鑒定

通常情況下，具有生長和繁殖能力的細(xì)胞被認(rèn)為具有細(xì)胞活性，存活率鑒定方法有些建立在細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上。使死細(xì)胞著色的常用染料有臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑、伊紅 Y，能使活細(xì)胞著色的常用染料有結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)等。其中最常用的是臺(tái)盼藍(lán)染色法，細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的 DNA 結(jié)合，使其著色，活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)可得出細(xì)胞的存活率[79]。雖然臺(tái)盼藍(lán)染色法操作簡(jiǎn)單，但細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)間不能太長，否則染料易進(jìn)入活細(xì)胞中，影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性[80]。FDA-PI 熒光染色法是基于活性細(xì)胞水解熒光素二乙酸酯（ FDA ），得到的熒光素在細(xì)胞內(nèi)累計(jì)從而發(fā)出綠色熒光，且細(xì)胞活性越高，發(fā)出的綠色熒光越強(qiáng)[81]。碘化丙啶（ PI ）與細(xì)胞內(nèi) DNA 和 RNA 物質(zhì)相互作用生成紅色熒光物，使死亡細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，通過 FDA-PI 雙重?zé)晒馊旧?，在熒光顯微鏡下，紅色與綠色區(qū)別明顯[80];有些研究則建立在對(duì)細(xì)胞代謝活性的檢測(cè)上，例如以細(xì)胞還原四唑鹽或水解熒光底物的速率表示細(xì)胞相對(duì)活性的強(qiáng)弱[82]。檢測(cè)細(xì)胞活性的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值。

4? 展望

目前，超低溫保存主要應(yīng)用于種質(zhì)資源活體保存。超低溫保存的技術(shù)方法較多，但應(yīng)用較多的主要有3 種：兩步冷凍法、玻璃化法和包埋干燥法。兩步冷凍法需要解決的關(guān)鍵技術(shù)是嚴(yán)格控制降溫速率;玻璃化法設(shè)備簡(jiǎn)單，凍存組織復(fù)蘇存活率較高、恢復(fù)生長快，操作程序簡(jiǎn)單方便，但冷凍保護(hù)劑中的DMSO 和乙二醇對(duì)材料造成毒害作用;包埋干燥法步驟復(fù)雜，相對(duì)玻璃化法而言，包埋干燥法的優(yōu)點(diǎn)在于避免使用 DMSO 和乙二醇等對(duì)細(xì)胞有毒性的冰凍保護(hù)劑。包埋玻璃化法結(jié)合了玻璃化與包埋干燥的優(yōu)點(diǎn)，可能會(huì)成為今后超低溫保存的主流方法。此外，使用蔗糖、山梨糖醇、 DMSO、甘油等冷凍保護(hù)劑有助于緩解細(xì)胞脫水過程中的細(xì)胞損傷，但目前還沒有一種能普遍應(yīng)用于所有植物的方法。為了提高超低溫保存材料的存活率，需要做的工作還相當(dāng)多，如研究更安全的冷凍保護(hù)劑和處理方法，探討低溫保護(hù)劑的可行性和安全性，優(yōu)化解凍復(fù)蘇過程等。

超低溫保存在植物生物育種和組培育苗領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。通過基因編輯和遺傳轉(zhuǎn)化開展生物育種是定向培育新品種的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)椰子、油棕、檳榔等多年生熱帶作物而言尤為重要。通過基因編輯和遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)制的新種質(zhì)或突變體庫材料可以愈傷組織的形式進(jìn)行超低溫長期保存，成本低且安全可靠;解凍復(fù)蘇后可再通過組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)?；庇誀钜恢碌慕M培苗，對(duì)于熱帶作物種苗繁育及新品種試種具有重要應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯林海妹）