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        凍干人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)非臨床安全性研究

        2022-04-04 07:09:00譚小東楊世龍王麗許娜娜徐文龍周沛張艷飛周鋒
        安徽醫(yī)藥 2022年4期
        關(guān)鍵詞:藥組凍干狂犬病

        譚小東,楊世龍,王麗,許娜娜,徐文龍,周沛,張艷飛,周鋒

        狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人獸共患傳染病,一旦發(fā)病,病死率幾乎100%[1]。接種疫苗是預(yù)防狂犬病唯一有效的方式,其中人二倍體細(xì)胞基質(zhì)(如MRC-5 細(xì)胞)生產(chǎn)的狂犬病疫苗有著免疫效果好、副反應(yīng)低、免疫持久性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[2-7]。本研究根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則要求,分別從全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)(研究專題代號(hào)12006-14001)、肌肉刺激性(研究專題代號(hào)12006-13004,12006-16001)、單次給藥毒性(研究專題代號(hào)12006-13001)和溶血性(研究專題代號(hào)12006-13002)四個(gè)方面,評(píng)價(jià)凍干人用狂犬病疫苗(MRC-5 細(xì)胞)的非臨床安全性?,F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 疫苗凍干人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)按照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制備,檢定合格后用于動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)研究,批號(hào)分別為20140101和20141104。系采用MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)PM株狂犬病病毒,經(jīng)滅活、純化和凍干后制得。疫苗成品中含有人血白蛋白等賦形保護(hù)劑。

        對(duì)照疫苗系市售凍干人用狂犬病疫苗(Vero 細(xì)胞,廣州諾誠(chéng)生物制品股份有限公司,批準(zhǔn)文號(hào)S20083040,批號(hào)201308073-2),含有人血白蛋白等賦形保護(hù)劑。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性研究用清潔級(jí)新西蘭白兔購(gòu)自山東青島康大生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)分別為0021455和0025613,青島康大生物科技有限公司簽發(fā);實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)分別為SCXK(魯)20110001 和SCXK(魯)20160002,由山東省科學(xué)技術(shù)廳簽發(fā)],SPF級(jí)Hartley豚鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)11400700063326,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司簽發(fā);實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(京)2012-0001,由北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)簽發(fā)],SPF級(jí)ICR小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為2008001639387,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司簽發(fā),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(滬)2013-0016]。

        本研究起止時(shí)間為2014年3月至2016年10月,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),所有存活的動(dòng)物均實(shí)施安樂(lè)死。

        1.3 安全性研究該研究根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(NMPA)《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》[8]、《預(yù)防用生物制品臨床前安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》[9]、《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[10]和《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[11]要求,制定相關(guān)研究方案并執(zhí)行。

        1.3.1 全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn) 取SPF 級(jí)Hartley 豚鼠共84只,稱重后按其性別和體質(zhì)量通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)化分配步驟分為六組,每組12只動(dòng)物,雌雄各半。

        試驗(yàn)分為兩個(gè)階段,第一階段為致敏階段,隔日注射1 次,共給藥3 次。低劑量和高劑量給藥組給予凍干人用狂犬疫苗(MRC-5 細(xì)胞),每只劑量分別為不低于1.25 IU 和不低于2.5 IU,上市對(duì)照組每只不低于2.5 IU 給予凍干人用狂犬病疫苗(vero 細(xì)胞)、陽(yáng)性對(duì)照組每只給予卵清蛋白2 mg、兩種賦形劑對(duì)照組分別為含人血白蛋白和不含人血白蛋白。通過(guò)腹腔注射,低劑量組每只按0.5 mL 給藥,其余組均按每只1.0 mL給藥。

        第二階段為激發(fā)階段。各組在末次致敏注射后第14天或第21天激發(fā)一次。通過(guò)足靜脈推注給藥,低劑量組按日1.0 mL給藥、其余組均按日2.0 mL給藥。

        實(shí)驗(yàn)期間每天進(jìn)行一次詳細(xì)的動(dòng)物臨床觀察,并根據(jù)觀察結(jié)果評(píng)價(jià)動(dòng)物全身致敏性情況。全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)[12],分別標(biāo)記為陰性“-”、弱陽(yáng)性“+”、陽(yáng)性“++”、強(qiáng)陽(yáng)性“+++”和極強(qiáng)陽(yáng)性“++++”。

        1.3.2 單次給藥肌肉刺激試驗(yàn) 取清潔級(jí)新西蘭白兔,稱重后按其性別和體質(zhì)量通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)化分配步驟分為兩組,每組雌雄各2只,分別作為賦形劑對(duì)照組和給藥組。

        賦形劑對(duì)照組給予疫苗賦形劑(含人血白蛋白),給藥組給予疫苗。賦形劑對(duì)照組和給藥組每只按1.0 mL 給藥體積,通過(guò)左側(cè)股四頭肌給藥1 次(d0)。動(dòng)物分2 次解剖檢查,每組首次各剖檢2 只,雌雄各半;第二次剖檢余下動(dòng)物。兩次解剖時(shí)間分別為給藥后96 h(d4)和恢復(fù)末期(d17),肉眼觀察肌肉刺激反應(yīng)并參照文獻(xiàn)[13]分級(jí),同時(shí)進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查。

        1.3.3 多次給藥肌肉刺激試驗(yàn) 分組、給藥體積和注射部位按照1.3.2項(xiàng)方法,分別在d0、d3、d7、d14和d28給藥1次,共5次。動(dòng)物分2次解剖檢查,每組首次各剖檢2只,雌雄各半;第二次剖檢余下動(dòng)物。兩次解剖時(shí)間分別為末次給藥后96 h(d4)和恢復(fù)末期(末次給藥后d17),肉眼觀察肌肉刺激反應(yīng)并參照文獻(xiàn)[13]分級(jí),同時(shí)進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查。

        1.3.4 單次給藥毒性 取SPF 級(jí)ICR 小鼠共60 只,稱重后按其性別和體質(zhì)量通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)化分配步驟分為3組,每組20只動(dòng)物,雌雄各半。

        參考小鼠經(jīng)肌內(nèi)注射的最大給藥容量(10 mL/kg)及供試品最大給藥濃度設(shè)定本試驗(yàn)的高劑量,將高劑量的1/2 作為本試驗(yàn)的低劑量,即25 IU/kg 和50 IU/kg兩個(gè)劑量水平的給藥組,同時(shí)設(shè)置1個(gè)賦形劑對(duì)照組。對(duì)照組和50 IU/kg劑量組按10 mL/kg 的給藥體積,25 IU/kg 劑量組按照5 mL/kg 的給藥體積。左右后肢肌肉各選取1 個(gè)位點(diǎn)注射,兩個(gè)位點(diǎn)注射體積相同。單次給藥,觀察其臨床反應(yīng),監(jiān)測(cè)體質(zhì)量、耗食量、大體解剖、臟器重量等指標(biāo),并計(jì)算臟器重量與體質(zhì)量比值、臟器重量與腦重比值。

        1.3.5 溶血性試驗(yàn) 制備兔血紅細(xì)胞用氯化鈉注射液配成2%體積分?jǐn)?shù)的混懸液,備用。

        參照文獻(xiàn)方法[14],設(shè)置供試品組為1-5 號(hào)管,陰性對(duì)照組為6 號(hào)管,陽(yáng)性對(duì)照組為7 號(hào)管;另外增加8號(hào)管為賦形劑對(duì)照組。依次加入2%紅細(xì)胞懸液、氯化鈉注射液或去離子水、不同體積供試品,混勻后,立即置(37±1.0)℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫育3 h。期間觀察并記錄結(jié)果。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Office Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)分析,豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;單次給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)比較采用One way ANOVA 檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果所有動(dòng)物均存活到激發(fā)前,分組當(dāng)日、首次致敏、末次致敏以及兩次激發(fā)當(dāng)日稱重結(jié)果表明,各組雌雄豚鼠體質(zhì)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。第14 天和第21 天激發(fā)結(jié)果見(jiàn)表1,2。從過(guò)敏反應(yīng)程度和發(fā)生率來(lái)看,除不含人血白蛋白的賦形劑組未見(jiàn)過(guò)敏反應(yīng)外,其余各組均發(fā)生不同程度的過(guò)敏癥狀,過(guò)敏發(fā)生率為100%。從豚鼠過(guò)敏病死率來(lái)看,第14 天或第21 天激發(fā)后,不含人血白蛋白的賦形劑對(duì)照組病死率均為0,含有人血白蛋白的賦形劑對(duì)照組病死率分別為0 和33.33%,低劑量組病死率分別為0 和50%,高劑量組病死率分別為16.67%和33.33%,上市對(duì)照組病死率分別為66.67%和83.33%,陽(yáng)性對(duì)照組病死率均為100%。低劑量組、高劑量組和賦形劑對(duì)照組(含人血白蛋白)之間病死率比較,第14 天激發(fā)后組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.12,P=0.347),第21天激發(fā)后組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.47,P=0.792)。

        表1 豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天激發(fā))

        2.2 單次給藥肌肉刺激試驗(yàn)結(jié)果賦形劑對(duì)照組和給藥組動(dòng)物注射部位在實(shí)驗(yàn)期間均未見(jiàn)異常,刺激反應(yīng)評(píng)分為0分(無(wú)明顯變化)。局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果如表3 所示,給藥后96 h(d4),給藥組可見(jiàn)1 只家兔給藥部位(左側(cè)股四頭?。┬≡钶p微單核細(xì)胞浸潤(rùn);恢復(fù)末期(給藥后d17),動(dòng)物左右側(cè)股四頭肌均正常。

        表2 豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果(第21天激發(fā))

        表3 單次給藥兔肌肉刺激試驗(yàn)局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果

        2.3 多次給藥肌肉刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果賦形劑對(duì)照組和給藥組注射部位肉眼觀察未見(jiàn)異常,刺激反應(yīng)評(píng)分為0分(無(wú)明顯變化)。局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果如表4 所示,末次給藥后96 h(d4),賦形劑對(duì)照組和給藥組各有2只家兔給藥部位出現(xiàn)輕度至中度單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn);恢復(fù)末期(末次給藥后d17),給藥組可見(jiàn)1只家兔給藥部位輕度單核細(xì)胞浸潤(rùn)。所有動(dòng)物右側(cè)股四頭肌(未給藥)正常。

        表4 多次給藥兔肌肉刺激實(shí)驗(yàn)局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果

        2.4 單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)動(dòng)物死亡或?yàn)l死,適應(yīng)期及觀察期均未見(jiàn)異常。給藥前、給藥當(dāng)日、給藥后1周和2周小鼠體質(zhì)量結(jié)果見(jiàn)表5,給藥前后小鼠體質(zhì)量增加;且高劑量組、低劑量組和賦形劑對(duì)照組之間,無(wú)論雌性或雄性小鼠的體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),顯示疫苗未對(duì)體質(zhì)量增長(zhǎng)產(chǎn)生影響;耗食量、大體解剖、臟器重量、臟器重量與體質(zhì)量比以及臟器重量與腦重比,均未見(jiàn)與給予疫苗相關(guān)的異常變化。由此可見(jiàn),兩個(gè)劑量水平的凍干人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)均沒(méi)有明顯的毒性反應(yīng),疫苗最大耐受量(MTD)>50 IU/kg。

        表5 單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量變化(n=10)/(g,xˉ±s)

        2.5 溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果孵育前,除陽(yáng)性對(duì)照組顏色較紅有溶血現(xiàn)象外,其余各組試管內(nèi)紅細(xì)胞分布均勻;孵育期間,供試品、賦形劑對(duì)照和陰性對(duì)照組肉眼觀察可見(jiàn)紅細(xì)胞緩慢下沉,上清液體無(wú)色澄明;陽(yáng)性對(duì)照組溶液顏色較紅,呈澄明紅色。孵育3 h 后,手動(dòng)顛倒搖勻各組試管,未見(jiàn)棕紅色或紅棕色絮狀沉淀,無(wú)凝聚現(xiàn)象發(fā)生。

        3 討論

        臨床使用時(shí),疫苗中由于含外源蛋白、明膠和抗生素等,或可導(dǎo)致嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)[14-15]??袢∫呙缫?yàn)闅埩粲薪?jīng)過(guò)滅活處理的人血白蛋白,以及宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA 以及殘留的牛血清白蛋白等常常引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)和局部刺激反應(yīng)[14-17]。

        疫苗保護(hù)劑中添加的人血白蛋白,因?yàn)榉N屬關(guān)系常會(huì)引起豚鼠過(guò)敏反應(yīng),豚鼠主動(dòng)過(guò)敏實(shí)驗(yàn)常常無(wú)法完全排除狂犬病疫苗抗原和保護(hù)劑成分潛在的過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)[18]。通過(guò)設(shè)立不含抗原成分的對(duì)照組,比較過(guò)敏反應(yīng)程度和發(fā)生率,可以研究抗原成分是否會(huì)引起或加重過(guò)敏[19]。為此,本研究分別設(shè)置了兩種賦形劑對(duì)照組。研究結(jié)果顯示,疫苗組和上市對(duì)照組因在凍干保護(hù)劑中添加了人血白蛋白,從而引起豚鼠出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。不含人血白蛋白的賦形劑組過(guò)敏反應(yīng)呈現(xiàn)陰性,確認(rèn)該疫苗過(guò)敏反應(yīng)與賦形劑其他組分無(wú)關(guān)。含有人血白蛋白的賦形劑組、低劑量組、高劑量組疫苗三者相較,過(guò)敏反應(yīng)程度相似、過(guò)敏發(fā)生率均為100%;三組動(dòng)物病死率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此可以判斷過(guò)敏反應(yīng)與疫苗抗原成分無(wú)關(guān)。人血白蛋白不會(huì)引起人體過(guò)敏反應(yīng),且疫苗中添加的人血白蛋白為市售的批簽發(fā)制品,效期滿足疫苗有效期,能夠保證人體內(nèi)使用時(shí)安全性。

        考慮到現(xiàn)有“五針?lè)ā泵庖叱绦蚩赡茉谕徊课唤o藥5 針[20],本研究同時(shí)設(shè)計(jì)了單次和多次給藥肌肉刺激實(shí)驗(yàn)。多次給藥肌肉刺激后,賦形劑組和給藥組均出現(xiàn)給藥側(cè)股四頭肌輕度至中度單核細(xì)胞浸潤(rùn),該現(xiàn)象為常見(jiàn)的注射針穿刺造成的損傷以及機(jī)體對(duì)損傷的修復(fù)或反應(yīng)性變化。對(duì)照組和給藥組注射部位觀察以及局部組織病理學(xué)檢查均未見(jiàn)與疫苗相關(guān)的異常。

        在本研究條件下,凍干人用狂犬病疫苗(MRC-5細(xì)胞)在豚鼠中引起的過(guò)敏癥狀,與疫苗抗原成分無(wú)關(guān);單次和多次肌內(nèi)注射均不會(huì)引起家兔肌肉刺激性反應(yīng);給藥最高劑量50 IU/kg 時(shí),未見(jiàn)明顯的毒性反應(yīng);疫苗自身也不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血和凝聚。

        綜上所述,動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,采用MRC-5 細(xì)胞制備的凍干人用狂犬病疫苗具有良好的安全性。

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