牛彥波，安 琦，原 韜，曹亞彬

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

玉米是黑龍江省的主要農(nóng)作物，其產(chǎn)量居于全省第一。年種植玉米面積近667萬hm2[1]，因此每年玉米秸稈的產(chǎn)量較大。玉米秸稈在自然狀態(tài)下營養(yǎng)價值很低，粗纖維含量高，消化率低，適口性差，作為牲畜的粗飼料品質(zhì)不佳，飼喂營養(yǎng)價值較低，動物對秸稈采食量低。然而，玉米秸稈黃貯能夠降低粗纖維的含量，改善其適口性，從而促進動物采食，提高秸稈飼料化的利用率。研究表明，黃貯可以保留秸稈中85%的養(yǎng)分，令秸稈多汁，柔軟，適口性更佳。黃貯秸稈比干秸稈更能刺激反芻動物的食欲，促進其消化腺分泌，令反芻動物飼料采食速度和采食量分別提高43%、20%[2]。玉米秸稈黃貯添加酶制劑是近年來的研究熱點。纖維素酶能將植物中的纖維素降解，變?yōu)楦菀妆粍游锵膯翁俏镔|(zhì)，從而提高粗飼料的營養(yǎng)價值，因而纖維素酶的應用越來越廣泛。添加纖維素酶后，植物細胞壁被分解，產(chǎn)生的碳水化合物給乳酸菌發(fā)酵提供底物，產(chǎn)生乳酸，不斷促進秸稈發(fā)酵。1993年，趙長友等[3]研究發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶可以改善黃貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，提高營養(yǎng)成分，抑制霉菌生長，防止腐敗，提高窖貯的完好率。薛艷林等[4]報道，纖維素酶制劑處理黃貯小麥，可以顯著降低黃貯飼料的pH值及ADF、NDF、氨態(tài)氮含量，還顯著提高了LA、揮發(fā)性脂肪酸和CP的含量。但是，目前關于黃貯玉米秸稈中添加纖維素酶的效果結果并不一致，原因可能有多種，如玉米秸稈種類的差異、酶種類的差異、酶活標記不準確、黃貯時間及方式不統(tǒng)一等。酶制劑的應用也受到了應用條件的制約，其中溫度的影響至關重要。低溫條件下，酶解效果會受到嚴重影響，所以在應用上存在問題。利用纖維素酶降解玉米秸稈中的粗纖維水平，通過測定不同黃貯階段NDF、ADF和乳酸菌的變化來驗證纖維素酶在玉米秸稈降解中的作用。

1 材料

酶制劑：諾維信液體酶制劑，酶活10 000 U/g。玉米秸稈：由市場購買。MRS固體培養(yǎng)基配方：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉 4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂 0.2 g、檸檬酸三銨 2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、瓊脂粉18 g、水1 000 ml ，pH 6.2±0.2，121℃20 min滅菌。

2 試驗方法與內(nèi)容

2.1 試驗方法

玉米秸稈的處理方法：在自然風干后碾碎，用鍘刀將其切短到 2～4 cm ，再用粉碎機粉碎至1～0.5 cm。玉米秸稈黃貯時使用2～4 cm的干秸稈。干秸稈的水分含量小于10%。

酶液的處理：取原酶液10 mL，加入到90 mL純凈水中，為含酶量10%的稀釋酶液，混勻備用。

測定方法：活菌數(shù)的測定采用稀釋平板法；中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)依照Van Soest等方法進行測定。

數(shù)據(jù)分析：采用Excel97-2003和SPSS Statistics 17.0數(shù)據(jù)分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2.2 試驗內(nèi)容

2.2.1 溫度對纖維素酶水解玉米秸稈的影響

采用減重法，將溫度設定為15℃、30℃、45℃，振蕩，pH自然，天數(shù)設定為5 d。將經(jīng)過處理的干秸稈裝入濾袋中，每袋加入秸稈1 g左右，用塑封機封口，編號，待用。每克秸稈樣品中加入稀釋后的酶液0 uL、0.5 uL、2 uL、4 uL。每個處理3個重復。將各處理樣品裝入不同的燒杯中，按照試驗設計加入不同的酶液，補充水分至100 mL，放置于不同的環(huán)境中進行處理，5 d后將各樣品停止處理，用純凈水清洗，直至水無色為止，傾去純凈水，置于80℃烘箱中烘干至恒重。

2.2.2 不同黃貯時間及不同纖維素酶添加量對樣品NDF、ADF及乳酸菌的影響

每個處理秤取玉米秸稈500 g，按照酶的添加量共設計6組，每克干秸稈中加入0 ug、0.5 ug、5 ug、50 ug、500 ug的夏盛全組分纖維素酶，添加1 000 mL純凈水，混拌均勻，分裝于5個抽真空密封袋中，每個處理3個重復。溫度設定為常溫25℃～30℃，每15 d、30 d、45 d、60 d取樣測定。

3 結果與分析

3.1 溫度與纖維素酶添加量對玉米秸稈的影響

從表1溫度對纖維素酶水解玉米秸稈的試驗與數(shù)據(jù)分析結果中發(fā)現(xiàn)，低溫不利于纖維素酶的作用，與其他溫度條件下對比，在P<0.05水平，具有顯著性的差異；溫度并不是越高越能促進纖維素酶的酶解，45℃與30℃的秸稈失重率之間差異不顯著；研究發(fā)現(xiàn)在15℃的低溫條件下酶解的時間會延長，但與對照之間仍存在著較顯著的差異，秸稈粗纖維的降解率提高了0.5%以上，30℃和45℃與對照比存在著顯著的差異，30℃時秸稈粗纖維的降解率提高了3.3%以上，45℃時秸稈粗纖維的降解率提高了5.4%以上；但在水解試驗中發(fā)現(xiàn)，酶量增加并不與降解率呈現(xiàn)正相關性，數(shù)據(jù)分析顯示，酶量的多少對于玉米秸稈的粗纖維降解并沒有顯著的差異。在添加纖維素酶4.0 uL組，30℃時酶水解能力反而高于45℃時酶水解玉米秸稈的失重率，說明酶解并沒有隨著溫度的升高與酶量的增加而提高，反而表現(xiàn)出抑制反作用，所以用纖維素酶處理秸稈僅需要適量的酶量和必要的溫度，而無須高酶量和相對高溫條件。

表1 溫度、酶量對玉米秸稈粗纖維的影響Tab.1 Effect of temperature and cellulaseon on crude fiber of corn stalk

3.2 黃貯天數(shù)與纖維素酶不同添加量對NDF、ADF、乳酸菌活數(shù)的影響

表2的結果顯示了玉米秸稈在不同黃貯天數(shù)、不同纖維素酶添加酶量條件下，對NDF、ADF、與乳酸菌活菌數(shù)量的影響關系。

表2 纖維素酶不同添加量與秸稈黃貯天數(shù)對NDF、ADF與乳酸菌的影響Tab.2 Effect of cellulase of different additive amounts and yellow corn straw storage days on NDF, ADF and lactic acid bacteria

從數(shù)據(jù)分析結果來看，添加纖維素酶與不添加纖維素酶，玉米秸稈NDF與ADF有顯著性的差異，添加纖維素酶后，玉米秸稈NDF與ADF在各個處理組中均有明顯的降低。在第30 d的結果中，添加量達到5 ug/g、50 ug/g、500 ug/g的處理組，NDF均值分別從82.27%下降了4.87%、9.77%、26.30%，第45 d的時候，分別從81.93%下降了6.67%、11.67%、21.47%，第60 d時分別從82%下降了6.03%、10.40%、26.87%，隨著添加量的增加，降解率增加。從天數(shù)來看，最初的30 d，降幅明顯，第60 d時降幅變化不大，說明纖維素酶的作用與時間并不是正相關性的，它的作用是有時效性的，ADF的結果分析與NDF纖維素酶的作用能力基本一致；從不同天數(shù)與不同纖維素酶添加量對樣品中的乳酸菌影響來看，酶量的增加與時間對乳酸菌的數(shù)量均有顯著性差異，500 ug/g的處理組中，乳酸菌的活菌數(shù)量最高，第45 d以后活菌的數(shù)量達到了1.4×108cfu/g以上，超過同溫度下其他組別1～3個數(shù)量級。說明纖維素酶的添加有效地將秸稈中的大分子物質(zhì)進行了降解，小分子糖類物質(zhì)的增加促進了厭氧條件下乳酸菌的活性，在開袋時聞到了比對照更大的酸香味，從側(cè)面驗證了加入適量纖維素酶促進了秸稈發(fā)酵中產(chǎn)酸微生物群落的繁殖。

天數(shù)數(shù)據(jù)采用LSD 分析方法，在P<0.05時，*表示差異顯著。

4 討論

通過以上研究可以確定，在玉米秸稈黃貯過程中，添加纖維素酶能夠促進秸稈中粗纖維的降解，有利于產(chǎn)酸微生物乳酸菌的生長。隨著酶量的增加，NDF與ADF的下降幅度也在增加，但這種降幅與對照相比并不具有正相關性，隨著時間的延長，在45 d以后基本會處于穩(wěn)定期，這應該與秸稈中營養(yǎng)成分的消耗有關系。如果隨著黃貯時間的再延長，同等條件下，添加纖維素的組別與不添加纖維素的組別之間的差距會縮小，但縮小的幅度還需進一步的驗考證。乳酸菌的數(shù)量隨著酶量增加呈遞增趨勢，與對照相比差距極顯著，數(shù)量增加了3個數(shù)量級。隨著黃貯的時間延長，在同酶量水平下變化不顯著，僅是同一數(shù)量級內(nèi)的少量增加，這也符合微生物的生長曲線，在一定的階段處于穩(wěn)定。但纖維素酶的添加對玉米秸稈黃貯過程中產(chǎn)酸微生物群落的貢獻是巨大的。干黃秸稈由于水分含量低，粗纖維含量高，微生物很難利用。在自然的黃貯狀態(tài)下，各類微生物需要漫長的過程進行代謝降解，黃貯時間長，降解效能低，加入纖維素酶之后，可以很快提高大分子物質(zhì)的降解，促進微生物對小分子物質(zhì)的利用，使其中的微生物快速繁殖，大大縮短了秸稈黃貯的時間，對秸稈的飼料化應用具有促進作用。