梁煥煥,賈全全,朱靈芝,黃麗莉,朱培林,★

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)·林學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；3.南昌市中藥材種植技術(shù)與質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013)

多花黃精(Polygonatum cyrtnema Hua.)是百合科黃精屬多年生草本植物，與黃精(P. sibiricum Red.)、滇黃精(P. kingianum Coll.et Hemsl.)一起收錄在中國藥典，是傳統(tǒng)食藥兩用的大宗藥材[1]。多花黃精廣泛分布于長江以南大部分地區(qū)，主要分布區(qū)有安徽、浙江、江西、湖北、湖南、福建、四川等地，生長于山坡陰處、林下、灌叢中，喜濕、忌積水[2]。

鮮黃精對咽喉有一定的刺激性，傳統(tǒng)黃精均對其進(jìn)行加工炮制后入藥或食用，目前黃精的炮制方法多種多樣，炮制參數(shù)各不相同，炮制前后外觀、口感、化學(xué)成分和藥理活性均有不同程度的變化[3]。歷代名醫(yī)典籍中記載的以九蒸九制炮制法最為常見[4-6]。馬佳麗等[7]通過對九蒸九制多花黃精炮制過程變化的研究得出：隨著炮制次數(shù)增加，多花黃精根莖顏色由淺變深，干重變化為先下降后逐漸趨于平緩，多糖則先增加后下降并逐漸趨于平緩。張洪坤等[8]在研究黃精九蒸九制過程中有效成分含量的變化情況得出：多糖含量明顯下降，皂苷含量則呈上升趨勢。為了使炮制黃精的藥效得到最大利用，可以對多花黃精不同蒸制次數(shù)和蒸制時間的化學(xué)成分變化進(jìn)行對比，以此找出不同含量達(dá)到最大所需的最佳炮制工藝[9]。

現(xiàn)代研究表明黃精多糖和皂苷類物質(zhì)是黃精中重要的成分，可明顯提高小鼠免疫功能[10-12]，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、防衰老、抗菌消炎、防動脈粥樣硬化以及保護(hù)心腦血管等功能[13-15]，而總酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化性[16]。黃精炮制后化學(xué)物質(zhì)含量會發(fā)生相應(yīng)的變化，同時產(chǎn)生了一些新的物質(zhì)，炮制后的多花黃精具有減毒增效的作用[17]。以往黃精九蒸九制含量變化的研究主要集中在多糖、皂苷、浸出物以及5-羥甲基糠醛等方面，關(guān)于總黃酮及總酚含量變化的研究未見報道。本研究參考傳統(tǒng)的蒸制方法，使用高壓蒸汽鍋進(jìn)行蒸制，分析九次蒸制后多花黃精的多糖、總皂苷含量變化情況，并且增加了炮制前后總黃酮和總酚含量的變化，以期為建立炮制多花黃精多指標(biāo)質(zhì)量評價模式提供理論依據(jù)，也為多花黃精的開發(fā)利用及優(yōu)良種源選擇提供參考。

1 試驗(yàn)材料

于2020年10 月21 日采自江西省安?？h的4 批多花黃精鮮品，經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院朱培林研究員鑒定為百合科黃精屬多花黃精根莖。其中安福種源的多花黃精分別有寬葉與窄葉2個類型，生長年限為4 a，安徽九華山和湖南懷化種源的多花黃精為寬葉類型，生長年限為3 a，詳細(xì)信息見表1。

表1 不同種源多花黃精地理氣候因子概況Tab. 1 A survey of geographical and climatic factors of P. cyrtnema from different provenances

2 方法

2.1 儀器與試劑

中藥粉碎機(jī)(永康市金穗機(jī)械制造廠)；ENXTN 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；MB35 水分測量儀(OHAUS)；MS105DU 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛朗儀器有限公司)；SP-752 紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

葡萄糖(B21882)、蘆丁(B20771)、人參皂苷 Rb1(B21050)、沒食子酸(B20851)，純度≥98 %，均購于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、硫酸、冰醋酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉等分析純均購于西隴科學(xué)股份有限公司，蒽酮(AR，Cool chemical science and technology(Beijing) Co. Ltd.)，香草醛(AR，上海麥克林生化有限公司)，高氯酸(AR，天津政成化學(xué)制品有限公司)，硝酸鋁(AR，上海展云化工有限公司)，福林酚(BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2.2 取樣、炮制

樣品洗凈并除去須根，待表面水分晾干，稱重，取一定量的樣品作為0 蒸樣品，將剩余鮮品放置高壓鍋中蒸至透心（約2～3 h），從中取出少量多花黃精1 蒸樣品，稱重并切片，放置烘箱中60 ℃烘干至恒重，將剩余樣品放置烘箱烘至表面微干，取出，繼續(xù)放置鍋中蒸制第2 次；依照此法依次進(jìn)行2～9 次蒸制并取樣，且2～9 次蒸制時間均為2 h，所有樣品烘干至恒重后打粉過4 號篩，備用。隨蒸制次數(shù)的增加多花黃精顏色逐漸變深（圖1）。

圖1 九蒸九制多花黃精粉末圖Fig. 1 Nine steamed nine P. cyrtnema essence powder diagram

2.3 多糖含量測定

黃精多糖含量測定參照2020 版《中國藥典》(一部)[1]中的方法，各組重復(fù)測定3 次。測得回歸方程為y=0.0415x+0.1659，R2=0.9911，在 0.0033～0.0198 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 總皂苷含量測定

2.4.1 對照品溶液配置

精密稱取人參皂苷Rb1 對照品7.91 mg，置于25 mL 量瓶中，用80 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.316 mg·mL-1的人參皂苷Rb1 對照品溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密量取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 對照品溶液于10 mL 具塞干燥試管中，60℃水浴揮干溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻，在冰水浴中加入0.8 mL 高氯酸，搖勻，冷卻后于60℃水浴加熱15 min，放入冰水浴2 min，加入5 mL 冰醋酸，搖勻，靜置5 min，于540 nm 處測定吸光度，以80 %乙醇溶液為空白對照，以人參皂苷Rb1 對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，測定的吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=0.0214x-0.0049，R2=0.9994，在 5.27～42.13 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 樣品含量測定

精密量取樣品粉末0.5 g，加入80%的乙醇溶液20 mL，60℃超聲50 min，提取兩次，將兩次濾液合并定容至25 mL 量瓶中，用80%乙醇定容，精密量取0.1 mL 樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定，每個樣品平行測定3 次，取平均值，計算總皂苷含量。

2.4.4 方法學(xué)試驗(yàn)

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取對照品溶液1 mL，一式5 份，按2.4.2 項(xiàng)下制備方法操作，在540 nm 處測定吸光度，計算得出各RSD 值，分別為1.67%、0.84%、2.53%。

回收率試驗(yàn)：取多花黃精藥材1 g，一式5 份，分別加入1 mL 對照品溶液，按2.4.2 項(xiàng)下制備方法操作，在540 nm 處測定吸收度，計算總皂苷平均加樣回收率為101.96%，RSD 為1.09%。

2.5 總黃酮類含量測定

2.5.1 對照品溶液配置

精密稱取蘆丁對照品10 mg，置于50 mL 量瓶中，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密量取 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 對照品溶液于10 mL 具塞干燥試管中，各加入70%的乙醇溶液5 mL，搖勻，依次加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，放置15 min 后立即于510 nm 處測定吸光度。以蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，測定的吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程 y=0.0136x+0.0149，R2=0.9997，在 10～60 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 樣品含量測定

精密稱取黃精細(xì)粉1 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，加入70%的乙醇溶液20 mL，超聲 (250 W，40 kHz)提取50 min，過濾，用70%乙醇定容至25 mL 容量瓶中。取5 mL 樣品溶液，依2.5.2 項(xiàng)下制備方法測定其吸光度，并計算含量，每個樣品平行測定3 次，取平均值。

2.5.4 方法學(xué)試驗(yàn)

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取對照品溶液1 mL，一式5 份，按2.5.2 項(xiàng)下制備方法操作，在510 nm 處測定吸光度，計算得出各RSD 值分別為0.91%、2.82%、1.96%。

回收率試驗(yàn)：取多花黃精藥材1 g，一式5 份，分別加入1 mL 對照品溶液，按2.5.2 項(xiàng)下制備方法操作，在510 nm 處測定吸收度，計算平均加樣回收率為 97.85%，RSD 為 2.42%。

2.6 總酚類含量測定

2.6.1 對照品溶液的配置

精密稱取沒食子酸對照品5.58 mg，置于50 mL量瓶中，加入10 mL 的80%乙醇溶液。超聲使其充分溶解，再用80%乙醇定容至40 mL，所得對照品溶液的濃度為 0.116 mg·mL-1，搖勻備用。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密吸取對照品溶液 0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶中，依次加入5.0 mL 離子水，搖勻，加入福林酚顯色劑0.5 mL，充分振蕩后靜置5 min，加入15%碳酸鈉溶液1.0 mL。搖勻，用去離子水定容至刻度，在室溫下避光放置反應(yīng)2 h。765 nm波長處測定吸光度，以沒食子酸對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，測定的吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=0.0905x+0.0065，R2=0.9991，在 1.1～9.9 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.3 樣品含量測定

精密稱取黃精樣品1 g，加入80%乙醇10 mL，超聲20 min，離心，提取2 次，取上清液定容至50 mL 容量瓶中備用。取2 mL 溶液，按照2.6.2 項(xiàng)下制備方法測定其含量。每個樣品平行測定3 次，取平均值。

2.6.4 方法學(xué)試驗(yàn)

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)，分別取對照品溶液1 mL，一式5 份，按2.6.2 項(xiàng)下制備方法操作，在765 nm 處測定吸光度，計算得出各RSD 分別為0.84%、0.35%、0.80%。

回收率試驗(yàn)：精密稱取多花黃精藥材1 g，一式6份，分別加入1 mL 沒食子酸對照品溶液，按2.6.2 項(xiàng)下制備方法操作，測定總酚含量，計算回收率，平均加樣回收率為98.91%，RSD 為0.66%。

3 結(jié)果與分析

3.1 炮制多糖含量變化

炮制過程中多糖含量變化總體呈下降趨勢，鮮樣品多糖含量從高到低分別是江西安福的寬葉多花黃精13.54%＞窄葉多花黃精9.48%＞懷化多花黃精8.29%＞九華山多花黃精7.38%。1 蒸后多糖含量顯著降低，4個樣品多糖含量分別下降了82.84%、73.92%、63.08%、61.94%。2 蒸之后多花黃精多糖含量變化平緩，基本穩(wěn)定在2.60%～2.96%，且4個樣品變化趨勢一致（圖2A）。

圖2 不同種源多花黃精的各化學(xué)成分含量隨蒸制次數(shù)變化Fig. 2 The contents of chemical components of P. cyrtnema from different provenances varied with steaming times

3.2 炮制總皂苷含量變化

炮制過程中總皂苷含量變化總體呈先上升后下降的趨勢，九華山多花黃精1 蒸后含量有較明顯的上升且達(dá)到最大值13.8%，江西安福的寬葉多花黃精、窄葉多花黃精、懷化多花黃精均在4 蒸后含量最高，最大值分別為13.1%、16.3%、13.5%（圖2B）。

3.3 炮制總黃酮含量變化

炮制過程中總黃酮含量整體呈上升趨勢，其中0～2 蒸緩慢上升，2～4 蒸黃酮含量變化較大，之后趨于平緩（圖2C）。九華山多花黃精含量變化幅度最大為0.74%，而懷化多花黃精變化幅度最小為0.62%，除窄葉黃精在7 蒸后含量達(dá)到最高0.71%外，寬葉多花黃精、九華山多花黃精、懷化多花黃精均在6 蒸后含量最高，分別為0.69%、0.82%、0.71%。

3.4 炮制總酚含量變化

炮制過程中總酚含量整體呈上升趨勢，其中0～2蒸緩慢上升，3 蒸含量明顯升高，4 蒸之后含量變化略有起伏且逐漸趨于穩(wěn)定（圖2D）。九華山多花黃精含量變化幅度最大為2.73 %，而江西安福窄葉多花黃精變化幅度最小為1.94%，各總酚含量的最大值分別是2.21%、2.12%、2.89%、2.23%。

4 結(jié)論與討論

本文通過分析同一種源地不同類型和不同種源地間多花黃精9 次炮制過程各化學(xué)成分含量的變化，結(jié)果初步揭示了同一種源地不同類型和不同種源地的多花黃精炮制過程化學(xué)成分變化規(guī)律具有一致性。但多花黃精的種源地及樣品數(shù)量較少，不能涵蓋多花黃精所有分布地區(qū)，需要擴(kuò)大研究范圍。此外多花黃精炮制后藥材的外觀、色澤及口感對食品開發(fā)也有較大的影響，因此可以對炮制后藥材化學(xué)成分及外觀等進(jìn)行綜合評價，以期為多花黃精的開發(fā)利用提供參考。

4種化學(xué)成分含量的變化達(dá)到穩(wěn)定所需時間和蒸制次數(shù)均不相同，從多糖含量變化的情況得出，多花黃精炮制的最好方法為1 蒸；總皂苷含量在4 蒸后不再增加，炮制次數(shù)以4 次最佳；總黃酮含量4 蒸后變化逐漸變緩，6 蒸后趨于平穩(wěn)，炮制次數(shù)以6 次最佳；總酚含量3 蒸之后逐漸趨于穩(wěn)定，炮制最好方法為3 蒸。為了使多花黃精藥材發(fā)揮更好的藥效，可以針對不同化學(xué)成分需求來選擇炮制的次數(shù)和時間。

本文采用高壓蒸汽鍋蒸制的多花黃精多糖含量在1 蒸后就不再有大幅度變化，說明高壓蒸制1 次后對多糖含量而言已達(dá)到穩(wěn)定，而許多古代典籍中常常記載的“九蒸九制”為常壓蒸制，認(rèn)為蒸制次數(shù)越多、時間越長品質(zhì)越好。高壓蒸制多花黃精，可以用更短的時間、更少的蒸制次數(shù)達(dá)到《食療本草》《本草圖經(jīng)》等典籍中記載的性狀特征[18-19]。王永祿等[20]研究的高壓蒸制酒黃精與常壓蒸制酒黃精的外觀色澤、質(zhì)地、氣味、口感等性狀無明顯差異；另外，本文研究的高壓蒸制可以使各化學(xué)成分含量在更短時間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，便于規(guī)?；a(chǎn)。綜合評價本研究幾種化學(xué)成分含量變化情況，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本，3～6 蒸后各含量趨于穩(wěn)定，因此3～6 蒸多花黃精最適宜。另有研究表明高壓蒸制的多花黃精多糖含量高于常壓蒸制的[21]，而高壓蒸制與傳統(tǒng)炮制對黃精皂苷、黃酮和總酚類成分的變化情況是否有差異還不清楚，因此高壓蒸制與常壓蒸制對多花黃精多個指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)化機(jī)理有待進(jìn)一步研究。