肖戈 陸文洪

（湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 長沙 410005）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis,UC）是一種慢性、特發(fā)性、非特異性的腸道炎癥性疾病，常引起慢性炎癥和結(jié)腸黏膜層損傷[1]，病變部位可累及整個結(jié)腸[2]，以腹瀉、膿液、便血、體質(zhì)量減輕等為主要臨床癥狀，易反復發(fā)作，對患者的生活質(zhì)量造成極為嚴重的影響[3]。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，UC在亞洲人群中的年發(fā)病率約為6.3例/10萬人，且發(fā)病率呈逐年上升[4]。由于目前對UC的病因和發(fā)病機制不明確，治療仍以藥物控制癥狀為主。中醫(yī)學將UC歸屬于“臟毒、腸澼、泄瀉、腸風、腸癰”等疾病范疇。中醫(yī)認為濕熱是本病發(fā)病的基本病理因素之一，在該病的發(fā)病和治療過程中有重要影響[5]，因此中藥治療多以清熱燥濕為主。大量研究表明中藥有助于改善UC患者的臨床癥狀，且中藥聯(lián)合西藥能提高該病的治療效果[6]。中藥作為維持治療藥物在腸道炎癥性疾病專家共識意見中也被推薦用于UC的治療[7]。性味苦寒的黃芩-黃連是清熱燥濕的經(jīng)典藥對，二者均入大腸經(jīng)，擅于清除腸道濕熱，在UC的臨床治療過程中，二者常常相須而用以增強藥效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯[8]、半夏瀉心湯[9]、黃連解毒湯[10]和芍藥湯[11]均對UC有很好的臨床療效，而黃芩-黃連作為藥對，是這些方藥的主要藥味組成。且基于數(shù)據(jù)分析顯示，黃芩-黃連在炎性腸病的治療中用藥頻次及藥物關(guān)聯(lián)度均較高[12]。然而，尚未有研究對黃芩-黃連藥對治療UC的有效成分和靶點機制進行報道。本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析，對黃芩-黃連藥對治療UC的活性成分及靶點機制進行預測，為臨床應用黃芩-黃連藥對治療UC及進一步實驗探尋其作用機制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1 數(shù)據(jù)庫與分析方法

1.1 查找黃芩-黃連藥對活性成分以及作用靶點將“黃芩”和“黃連”輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）中進行查找，根據(jù)藥動學（ADME）條件篩選出有效成分：選擇口服生物利用度≥30%的有效成分，且其類藥性必須≥0.18，同時根據(jù)疾病特點將人結(jié)腸腺癌Caco-2細胞滲透性設(shè)定為≥-0.4，按照設(shè)定參數(shù)進行篩選。同時在數(shù)據(jù)庫中查找兩味藥物的targets，通過Perl軟件對靶點信息進行篩選，以獲得相應藥物活性成分及相應的靶點信息。并通過Unitprot轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一的gene symbol。

1.2 黃芩-黃連藥對治療UC的關(guān)鍵靶點篩選 以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCard和PharmGk數(shù)據(jù)庫中查找與UC相關(guān)的疾病靶點，同時利用R軟件（V3.6.1）上加載的“Venn Diagram”程序包，分析出“黃芩”和“黃連”中有效成分和治療UC疾病的共同靶點，從而獲得“黃芩、黃連”治療UC的關(guān)鍵靶點。

1.3 構(gòu)建并分析“藥物成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡 將篩選出的關(guān)鍵靶點和藥物活性成分信息編輯成關(guān)系文件和屬性文件，利用Cytoscape3.7.2軟件將結(jié)果構(gòu)建成藥物成分-靶點-疾病的交互網(wǎng)絡。節(jié)點為黃芩、黃連及其藥物的活性成分、關(guān)鍵靶點及UC，邊代表黃芩、黃連與其相應的活性成分、活性成分與相關(guān)關(guān)鍵靶點、靶點與UC之前的相互關(guān)系。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用 （Protein-Protein Interaction,PPI）網(wǎng)絡 通常疾病有多種相關(guān)蛋白質(zhì)分子，其在遺傳網(wǎng)絡、生物化學及信號轉(zhuǎn)導方面的相關(guān)性稱為PPI。在String數(shù)據(jù)庫中導入篩選出來的“黃芩-黃連”藥對治療UC的潛在作用靶點，在數(shù)據(jù)庫中將“medium confidence”設(shè)定為閾值，并將“Homo Sapiens”選擇為研究物種，置信度選擇0.4，其余參數(shù)選擇默認值，分析獲取蛋白互作關(guān)系。同時將TSV格式文件導出，采用Cytoscape3.7.2軟件將其繪制成蛋白互作網(wǎng)絡，通過節(jié)點大小反應degree值的大小，最終獲得PPI網(wǎng)絡圖。

1.5 進行GO（Gene Ontology）功能和KEGG通路富集分析 分析獲得的“黃芩-黃連”對UC治療的潛在作用靶點，并將其導入至David數(shù)據(jù)庫中，同樣需選擇人類為研究物種進行相關(guān)富集分析。GO富集分析主要從3個方面進行：生物過程、分子功能和細胞組成，并在KEGG數(shù)據(jù)庫中將條件設(shè)置為P＜0.05、Q＜0.05，分析獲得相關(guān)作用通路。從而分析出相關(guān)活性成分作用靶點顯著富集的主要功能和相應通路，進一步明確分析“黃芩、黃連”治療UC的可能作用機制。

2 結(jié)果

2.1 黃芩-黃連藥對活性成分及作用靶點篩選結(jié)果根據(jù)條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到黃芩-黃連藥對的活性成分共51個，靶點共631個，其中黃芩有效成分36個，靶點382個；黃連有效成分15個，靶點249個。

2.2 黃芩-黃連藥對治療UC關(guān)鍵靶點篩選結(jié)果以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards和PharmGkb數(shù)據(jù)庫中分別檢索到相關(guān)基因4 622個和15個，刪除5個重復基因后，最終得到4 632個UC相關(guān)基因。通過Perl軟件最終篩選出黃芩-黃連藥對和UC的交集靶點共136個，其中黃芩和UC的交集靶點66個，黃連和UC的交集靶點117個，黃芩、黃連和UC三者的共同靶點47個。見圖1。

圖1 黃芩-黃連藥對與UC共同靶點的Venn圖

2.3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建 在Cytoscape中導入黃芩、黃連兩味中藥，以及通過上述方法所得到的51個潛在活性成分及631個作用靶點，制作出“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡圖。見圖2。根據(jù)Degree值進行排名，統(tǒng)計前9位的靶點。見表1。

圖2 黃芩-黃連藥對治療UC“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖

表1 黃芩-黃連治療UC的靶點數(shù)排名前8位成分信息

2.4 PPI構(gòu)建結(jié)果 將查找到的數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建PPI圖。在PPI圖中，節(jié)點色彩越明亮，或在同一種色彩下節(jié)點的直徑越大，則說明該節(jié)點的Degree值越大。見圖3。將Degree值排名前14位的蛋白繪制成條形圖。見圖4。前5個蛋白從大到小分別為腫瘤蛋白53（TP53）、絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子JUN、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）和腫瘤壞死因子（TNF）。表明這些蛋白質(zhì)在“黃芩-黃連”藥對治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。再將PPI分析結(jié)果中Degree值排名前20的蛋白靶點與該藥對的有效成分進行網(wǎng)絡構(gòu)建，篩選靶點和活性成分節(jié)點之間邊數(shù)越多說明兩者的關(guān)聯(lián)程度越高。根據(jù)Degree值進行排名，獲得的活性成分中前8的依次為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、醋栗素、麝香草黃酮和5,7,4'-三羥基-8-甲氧基黃酮。見圖5。

圖3 “黃芩-黃連”治療UC的PPI圖

圖4 “黃芩-黃連”藥對治療UCPPI前14位蛋白Degree值條形圖

圖5 “篩選靶點-成分”網(wǎng)絡

2.5 GO富集分析 GO富集分析發(fā)現(xiàn)，依據(jù)Degree值排名，在2 226條“黃芩-黃連”治療UC的關(guān)鍵靶點中涉及生物過程（BP）的條目中，前5的條目為脂多糖反應細菌來源分子反應、氧化應激、活性氧反應、細胞氧化應激。在細胞組分（CC）中，排名前5的依次為膜、膜微區(qū)、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復合物和囊腔。血紅素結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性-直接配體調(diào)節(jié)序列的特異性DNA結(jié)合和四吡咯結(jié)合是分子功能（MF）中前5的富集基因。見圖6。

圖6 “黃芩-黃連”治療UC關(guān)鍵靶點基因的GO功能富集分析

2.6 KEGG富集分析及“通路-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建通過KEGG通路富集分析，共獲得165條與UC相關(guān)的信號通路，前10條分別是：人巨細胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、乙肝病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和AKT/蛋白激酶b（PI3K-AKT）信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、丙型病毒、癌癥中的蛋白多糖、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、人乳頭瘤病毒和甲型流感病毒感染。見圖7。通過Cytoscape3.7.2軟件制作出這20條通路與相關(guān)基因的網(wǎng)絡圖。見圖8。

圖7 “黃芩-黃連”藥對治療UC作用靶點的KEGG富集分析

圖8 “通路-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡圖

3 討論

黃芩和黃連均味苦性寒，為清熱燥濕、瀉火解毒之要藥，同時二者歸于肺經(jīng)、脾經(jīng)、膽經(jīng)、大腸經(jīng)和小腸經(jīng)，因此黃芩配伍黃連，能使清熱燥濕作用增強，可清瀉上、中、下三焦之實熱，且黃芩還入血分能涼血止血，從而減輕便血癥狀。朱丹溪在治療濕熱痢疾時指出：“脈大當清熱，非芩連不能清”。在歷代中醫(yī)名方中，葛根芩連湯、半夏瀉心湯、黃連解毒湯和芍藥湯等均以黃芩配伍黃連，用以治療“下利”等腸道疾病，同時現(xiàn)代研究也表明其均對UC有較好的臨床療效。然而，黃芩和黃連作為這些名方中的重要藥對，且藥理分析發(fā)現(xiàn)二者皆具有抗菌與免疫調(diào)節(jié)兩大方面的作用[13]，符合UC治療的需要。

本研究通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫篩選出黃芩-黃連藥對的活性成分51種，通過“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡分析，篩選出黃芩-黃連藥對治療UC可能的主要活性成分為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、金合歡素、千層紙素、蘇薺苧黃酮、β-谷甾醇、巴馬汀和5,7,4'-三羥基-8-甲氧基黃酮。同時通過PPI分析發(fā)現(xiàn)，UC治療的主要蛋白靶點為TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF和RELA等119個，將前20個蛋白靶點與對應的化合物成分構(gòu)建網(wǎng)絡，分析發(fā)現(xiàn)，度值排名前10的分別是槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、醋栗素、麝香草黃酮、5,7,4'-三羥基-8-甲氧基黃酮、β-谷甾醇、（2R）-7-羥基-5-甲氧基-2-苯基鉻-4-酮和巴馬丁。與前面篩選到的10種成分，取交集共得到6種成分，分別為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、5,7,4'-三羥基-8-甲氧基黃酮和巴馬丁。說明此6種成分為黃芩-黃連藥對治療UC最可能的有效成分。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，UC的發(fā)病受多種因素相互作用的影響，包括免疫、感染及內(nèi)部腸道微生物群等方面[14]。在對UC靶點蛋白進行PPI分析時，發(fā)現(xiàn)TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF是度值排名前5的關(guān)鍵靶點。TP53是一種分子量為53kDa的抑癌基因，與腫瘤的相關(guān)性最高，在UC癌變的患者中可檢測到不同的TP53突變[15]。而黃芩黃連藥對中的主要活性成分槲皮素通過甲基化可調(diào)控TP53表達，影響癌細胞的細胞活力，抑制UC癌變[16]，這可能是該藥對防止UC發(fā)生癌變的重要作用機制。同時，TNF參與機體免疫調(diào)節(jié)過程，具有促炎作用，參與腸道炎癥反應而介導UC發(fā)病[17]；c-JUN也是炎癥反應的主要調(diào)節(jié)因子，在結(jié)腸炎癥反應的病理過程中發(fā)揮重要作用[18]。而AKT1主要通過參與腸上皮細胞自噬來調(diào)節(jié)慢性腸道炎癥[19]，黃芩中的千層紙素被證實能有效抑制PI3K/AKT的表達[20]。此外，MAPK是將細胞表面信號轉(zhuǎn)導致細胞內(nèi)部的重要信號通路，參與細胞的增殖、分裂和凋亡，同時能影響細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放，與UC發(fā)病機制密切相關(guān)[21]，藥對中的主要活性成分黃芩素和漢黃芩素均對MAPK的表達有一定的調(diào)控作用[22]。

GO富集分析的結(jié)果表明，黃芩-黃連藥對治療UC通過作用于多種細胞組分參與生物過程，主要包括脂多糖、細菌來源分子的反應、金屬離子及活性氧的反應，氧化應激及細胞氧化應激，凋亡信號通路及活性氧代謝的調(diào)控等過程。通過KEGG通路富集分析，篩選黃芩-黃連藥對治療UC涉及的信號通路主要集中在PI3K-AKT、MAPK、病毒感染（如人巨細胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化和癌癥中的蛋白多糖信號通路等。到目前為止，實驗研究已經(jīng)證實本研究預測的黃芩-黃連藥對中的部分主要活性成分能通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶點通路的表達發(fā)揮對UC的治療作用。如槲皮素具有良好的抗氧化能力，可有效抑制結(jié)腸炎性損傷[23]，且其還能通過抗炎機制改善結(jié)腸炎癥[24]。巴馬丁可通過調(diào)節(jié)腸道菌群及抗炎抗菌作用治療結(jié)腸炎[25～26]。漢黃芩素能通過改善腸上皮屏障功能減輕結(jié)腸炎[27]；黃芩素可通過調(diào)節(jié)腸道菌群、短鏈脂肪酸以及調(diào)控MAPK通路抑制腸道炎癥治療UC[28～29]。同時，研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素[30～31]和千層紙素[32]均能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響腫瘤細胞的活性，這可能是該藥對影響UC向癌癥轉(zhuǎn)變的重要作用機制。然而部分通路，如AGE-RAGE等信號通路，與UC的發(fā)病是否有關(guān)，以及黃芩-黃連藥對配伍能否通過調(diào)控相關(guān)通路治療UC，仍然不得而知，需進一步驗證。

本次網(wǎng)絡藥理學分析預測的黃芩-黃連藥對治療UC的主要活性成分中，二者均含有Degree值排名靠前的活性成分，且二者所含主要成分的重要程度相當。分析該藥對主要活性成分治療UC的最主要靶點通路，預測其發(fā)揮治療作用與以下機理有關(guān)：（1）黃連中的槲皮素在UC的治療過程中具有抗氧化、抗炎及抑制癌變等作用，巴馬丁可調(diào)節(jié)腸道菌群，具有抗炎抗菌作用；（2）黃芩中的黃芩素、漢黃芩素、千層紙素等能有效調(diào)節(jié)UC腸道菌群，調(diào)控MAPK通路抑制炎癥，并通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路抑制UC癌變。同時，二者的主要有效成分已被證實對UC有很好的治療作用。可見，黃芩和黃連相須而用和單味藥物使用相比，會增加UC治療的活性成分，并能增加治療的靶點通路，從而可能提高治療效果。因此，黃芩和黃連配伍是治療UC的重要藥對。

綜上所述，黃芩-黃連藥對UC的治療作用主要體現(xiàn)在抗炎、抗氧化作用及抑制癌基因的表達等方面，具有“多組分-多靶點-多通路”等特點，可能主要涉及TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF等靶點及PI3K-AKT和MAPK等信號通路。然而由于本研究是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息的分析，并無實驗驗證，接下來需要進一步實驗研究以驗證預測的黃芩-黃連藥對治療UC的作用機制，從而為該藥對在UC的臨床治療應用中提供更充足的證據(jù)。