尹春蕾，劉榮榮，李麗娟，3*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.棗莊市疾病預(yù)防控制中心，山東棗莊 277000；3.大理大學(xué)瀾湄人類健康研究中心，云南大理 671000）

精神分裂癥是一種常見的重型精神疾病，累及世界1%的人口，其終身患病率為0.16%～1.21%〔1〕，伴有年齡和性別差異。該病多起于青壯年，以其思維、情感、人格和行為障礙的分裂，個(gè)性改變和精神活動(dòng)與其環(huán)境發(fā)生不協(xié)調(diào)為主要特征，通常無智能和意識(shí)障礙，一些患者會(huì)有認(rèn)知障礙。其病程多遷延，臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，對(duì)患者的身心健康及社會(huì)生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和社會(huì)負(fù)擔(dān)。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外對(duì)精神分裂癥的認(rèn)識(shí)在其疾病描述、發(fā)展規(guī)律、產(chǎn)生機(jī)制及防治領(lǐng)域等方面逐步深入。目前對(duì)于精神分裂癥與神經(jīng)發(fā)育和炎性免疫方面的研究關(guān)注較多。有研究者提出，腸道菌群可以調(diào)節(jié)人體的免疫炎性反應(yīng)并影響神經(jīng)發(fā)育，由此推測(cè)腸道菌群與精神分裂癥之間可能存有某種關(guān)聯(lián)〔2-3〕，然而，目前關(guān)于腸道微生物群與精神分裂癥關(guān)系的研究仍然有限。本研究對(duì)有無精神疾病家族史的精神分裂癥患者發(fā)作期和控制期的腸道菌群進(jìn)行測(cè)定，并比較精神分裂癥患者發(fā)作期和控制期兩個(gè)階段腸道菌群的差異以及精神疾病家族史對(duì)精神分裂癥患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)是否有影響，初步探知其精神疾病家族史、精神分裂癥患者病情控制與腸道菌群結(jié)構(gòu)的分布是否有關(guān)聯(lián)，了解精神分裂癥患者癥狀得以控制后腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的變化情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象將2017年12月至2018年8月在大理白族自治州第二人民醫(yī)院精神科住院，確診為精神分裂癥患者納入研究，共60例，入組時(shí)均為發(fā)作期組；經(jīng)過一段時(shí)間的治療，患者病情得到控制后為控制期組。考慮精神分裂癥的家族遺傳特性，本研究依據(jù)患者不同病期（發(fā)作期、控制期）與有無精神疾病家族史將研究對(duì)象分為4組，分別是發(fā)作期有家族史組（1-1組）、控制期有家族史組（1-2組）、發(fā)作期無家族史組（2-1組）和控制期無家族史組（2-2組）。結(jié)合入院第一次采樣結(jié)果，對(duì)不符合要求的患者給予剔除。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①中途出院失訪者；②合并患有肝膽胃腸道疾病、自身免疫性疾病及傳染病等其他疾病者；③出院診斷與入院診斷不一致者。最終納入研究患者共10例，男女各5例，有無家族史患者各5例。研究對(duì)象平均年齡為（39.70±9.11）歲，平均體質(zhì)指數(shù)為（22.71±2.29）kg/m2。研究經(jīng)大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，所有入組者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集與菌群提取 所有患者入院3 d內(nèi)采集一次早晨新鮮糞便，進(jìn)入控制期后再進(jìn)行一次糞便采集，均由研究人員收集，分裝，-80℃凍存。所有樣本收集完畢后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室處理，包括DNA提取，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化。

1.2.2 基因測(cè)序 利用羅寧生物Hiseq 2500平臺(tái)PE250模式上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析測(cè)序數(shù)據(jù)分析包括序列處理、物種注釋、群落組成分析、多樣性分析和物種差異分析等。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)無特殊說明均用（x±s）表示。兩組獨(dú)立樣本物種分析采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本物種分析采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較分析調(diào)整P值，α=0.05/2n（n為比較組數(shù)）時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本測(cè)序結(jié)果通過高通量測(cè)序，20個(gè)樣品共獲得843 516條Raw PE序列，對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控得到Clean Tags（去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)）784 844條。使用UCHIME算法去除嵌合體，得到760 123條Effective tags（高質(zhì)量有效序列）。對(duì)736 338條Effective tags在97%的一致性水平上進(jìn)行聚類共獲得1 756個(gè)OTUs（操作分類單元），其中，1-1組、2-1組、1-2組和2-2組中的OTUs數(shù)目分別為1 310、1 115、1 334和1 139個(gè)。各樣品的操作分類單元和高質(zhì)量有效序列數(shù)目見圖1。

圖1 各樣品操作分類單元和高質(zhì)量有效序列數(shù)目

2.2 腸道群落物種組成每個(gè)樣品注釋到各分類水平中通常包括界、門、綱、目、科、屬、種。所有樣品共注釋了30個(gè)門，62個(gè)綱，118個(gè)目，178個(gè)科和322個(gè)屬。本研究注釋的絕大部分菌群主要分屬于4個(gè)菌門：厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。厚壁菌門在4組樣品中的相對(duì)豐度均最高，與擬桿菌門、變形菌門和放線菌門構(gòu)成精神分裂癥患者的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。在綱水平上，患者腸道菌群中的梭桿菌綱、擬桿菌綱、γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱、Negativicutes綱和放線菌綱相對(duì)豐度較高。梭桿菌綱在4組樣品中的相對(duì)豐度均最高。在屬水平上，擬桿菌屬、糞桿菌屬、大腸埃希菌-志賀氏菌、乳桿菌屬、普雷沃氏菌屬9和罕見小球菌屬是患者的主要優(yōu)勢(shì)菌屬。

2.3 多樣性分析Alpha多樣性指數(shù)用于反映微生物群落的豐度、均勻性及多樣性。Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)常用來估算物種總數(shù)和多樣性，值越高代表物種越多、多樣性越豐富。Shannon指數(shù)用于評(píng)價(jià)樣本中物種構(gòu)成的豐度和均勻性，值越大表示該環(huán)境的物種越豐富，各物種分配越均勻。結(jié)果顯示，4組患者糞便菌群中的Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Shannon指數(shù)患者控制期有家族史組（1-2組）顯著低于發(fā)作期有家族史組（1-1組），控制期無家族史組（2-2組）顯著高于發(fā)作期無家族史組（2-1組），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；控制期有家族史組（1-2組）與控制期無家族史組（2-2組）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；發(fā)作期有家族史組（1-1組）顯著高于發(fā)作期無家族史組（2-1組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 精神分裂癥患者糞便菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.4 差異物種分析隨機(jī)森林分析可用來尋找重要的生物標(biāo)記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者控制期與發(fā)作期相比，優(yōu)勢(shì)物種是放線菌門的丙酸桿菌目、類諾卡氏菌科、阿托波菌屬、鏈霉菌屬和類諾卡氏菌屬，厚壁菌門的明串珠菌科、魏斯氏菌屬和糞球菌屬2；患者發(fā)作期優(yōu)勢(shì)物種是厚壁菌門毛螺菌科的CAG-56屬?；颊哂屑易迨方M的優(yōu)勢(shì)物種是擬桿菌門的F082菌科、擬普雷沃氏菌屬和厚壁菌門的糞球菌屬2；無家族史組的優(yōu)勢(shì)物種是變形菌門的琥珀酸弧菌科。提示4組腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，控制期組和有家族史組腸道菌群多樣性更加豐富，腸道菌群結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。見圖2。

圖2 隨機(jī)森林分析

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于16SrRNA基因研究的高通量測(cè)序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。16SrRNA是構(gòu)成原核生物核糖體小亞基組分，其基因序列中有10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)高變區(qū)域。物種間保守區(qū)域差異較小，高變區(qū)域因物種親緣關(guān)系的不同具有一定的種屬特異性，因而，選用16SrDNA發(fā)現(xiàn)不同物種的特征核酸序列，被廣泛應(yīng)用于微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的研究。人們對(duì)腸道菌群的關(guān)注也逐漸走向腸道微生物群整體多樣性、復(fù)雜性以及動(dòng)態(tài)性的研究，進(jìn)一步探討腸道菌群變化與人類健康和疾病的相關(guān)性，如腸易激綜合征、肥胖、高血壓、阿爾茨海默病、抑郁癥等〔4-7〕。由4組患者顯著差異物種分布結(jié)果可知，精神分裂癥患者的腸道微生物結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，患者病情控制對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)分布有影響，控制期組較發(fā)作期組顯著差異物種更加復(fù)雜豐富，有益菌群結(jié)構(gòu)和多樣性增加，提示精神分裂癥患者其病情控制與腸道菌群結(jié)構(gòu)可能存在關(guān)聯(lián)。精神分裂癥患者發(fā)作期較控制期腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生改變，控制期腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善，腸道有益菌群多樣性增加。精神疾病家族史可能對(duì)精神分裂癥患者腸道菌群結(jié)構(gòu)分布有影響，有家族史組比無家族史組顯著差異物種更加復(fù)雜豐富，腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性增加，并且發(fā)作期有家族史組比無家族史組顯著差異物種更豐富，有益菌群增加，控制期有家族史組比無家族史組顯著差異物種豐富，但有益菌群不顯著。提示精神分裂癥患者無家族史組比有家族史組腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量可能更易改變，并且精神疾病家族史可能對(duì)精神分裂癥患者發(fā)作期腸道菌群影響較大，而對(duì)精神分裂癥患者控制期腸道菌群影響不大。有遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，有家族史的精神分裂癥患者神經(jīng)系統(tǒng)軟體征更顯著，神經(jīng)系統(tǒng)的成熟和協(xié)調(diào)性受到明顯的影響，學(xué)習(xí)、領(lǐng)悟以及語言表達(dá)出現(xiàn)障礙，記憶能力發(fā)生損害〔8-9〕。說明有家族史的精神分裂癥患者神經(jīng)心理功能損害更為嚴(yán)重，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。大腦通過神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控胃腸功能，影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生變化〔10-11〕。提示精神分裂癥患者無家族史組可能易受外因影響，其疾病發(fā)作期時(shí)腸道菌群數(shù)量、結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生改變。而精神分裂癥患者有家族史組腸道菌群結(jié)構(gòu)可能本身就存在特征分布，不易受外因影響，其疾病發(fā)作期時(shí)有家族史組較無家族史組腸道菌群結(jié)構(gòu)不易改變?？刂破诓∏榘Y狀得到改善，腸道菌群結(jié)構(gòu)逐漸得以改善，腸道菌群多樣性增加，此時(shí)，精神疾病家族史對(duì)精神分裂癥影響較小。目前，關(guān)于精神疾病家族史對(duì)精神分裂癥患者腸道菌群影響的研究還比較缺乏，其對(duì)腸道菌群的具體影響作用還有待進(jìn)一步研究。

本次研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群中有很多菌群參與機(jī)體代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），如患者控制期組的乳酸桿菌屬、瘤胃梭菌屬9、毛螺菌屬、罕見小球菌屬和患者有家族史組的普雷沃氏菌屬2、瘤胃梭菌屬等顯著高于患者發(fā)作期組和無家族史組，它們可以促進(jìn)腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，保護(hù)腸道健康、加強(qiáng)胃腸道機(jī)能活動(dòng)，降低代謝障礙和炎癥反應(yīng)等的發(fā)生〔12-13〕，從而緩解精神分裂癥癥狀。

由于本研究的樣本量相對(duì)少、縱向采樣時(shí)間短，可能影響測(cè)序結(jié)果的穩(wěn)定性；雖然患者發(fā)病期和控制期來自同一研究對(duì)象，采用自身對(duì)照，但是組間存在個(gè)體差異，可能影響結(jié)果；研究對(duì)象來自同一醫(yī)院，短期內(nèi)飲食相似，采用聯(lián)合用藥，但未排除發(fā)病前期飲食、個(gè)人飲食習(xí)慣和具體用藥情況的差異。這提示在下一步的研究中應(yīng)增加樣本量，延長(zhǎng)縱向隊(duì)列觀察時(shí)間，同時(shí)控制飲食、藥物等因素對(duì)腸道菌群的影響，得出信度更高、更加全面的精神分裂癥患者腸道菌群的變化圖譜。另外，為了更好地確定精神分裂癥患者腸道菌群的變化特征，應(yīng)增加健康正常人組（無精神疾病家族遺傳史組和有精神疾病家族遺傳史組）樣本的采集，進(jìn)一步明確精神疾病家族史對(duì)腸道菌群的影響，為下一步人們根據(jù)菌群變化特征防治疾病，發(fā)展新的疾病防治思路提供可能。