陳亞男，石少敏，付 姿，劉漢福，姜 北，，沈 磊，*

（1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室（培育），云南大理 671000；2.大理大學藥學院，云南大理 671000）

鞍葉羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth.，又名馬蹄葉、大葉羊蹄甲、馬蹄飛等，屬于豆科羊蹄甲屬植物，全國多地均有分布，以云南分布最廣，為白族的一種民間用藥。白族用藥記載鞍葉羊蹄甲可抗炎、疏通經(jīng)絡、治療筋骨疼痛等〔1〕。課題組前期對84種滇西藥用植物進行篩選時發(fā)現(xiàn)鞍葉羊蹄甲對醋酸誘導的外周炎性疼痛的鎮(zhèn)痛活性最為顯著，對熱板所致的中樞性疼痛也有明顯鎮(zhèn)痛作用，可作為鎮(zhèn)痛藥使用〔2〕。目前主流的鎮(zhèn)痛藥療效肯定，但是不良反應較多，有的甚至還有成癮性〔3〕。鎮(zhèn)痛藥多具有中樞系統(tǒng)的不良反應，如中樞抑制、運動協(xié)調(diào)能力失衡、肌無力等〔4〕。鞍葉羊蹄甲可以作為鎮(zhèn)痛藥使用，但目前尚無報道研究其用藥安全性。因此，本研究擬探討鞍葉羊蹄甲的急性毒性，并主要觀察其對中樞系統(tǒng)的影響，為鞍葉羊蹄甲的安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物實驗完全依照大理大學實驗動物管理委員會的相關規(guī)定進行。

1.2 藥物與試劑鞍葉羊蹄甲于2019年8月采自大理漾濞，由大理大學藥學院生藥教研室張德全教授鑒定為豆科羊蹄甲屬植物鞍葉羊蹄甲B.brachycarpaBenth.，經(jīng)95%乙醇提取為粗提物后制成凍干粉，實驗時用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）制成混懸液供灌胃使用。水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：Q/12HB 4218-2017）；CMC-Na（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20080523）；4%組織細胞固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200831）。

1.3 儀器ZZ-6型小鼠自主活動儀、ZB-200型疲勞轉(zhuǎn)棒儀（成都泰盟科技有限公司）；全自動動物血液細胞分析儀（南京普朗醫(yī)療設備有限公司）。

2 方法

2.1 預實驗 對鞍葉羊蹄甲粗提物的溶解度進行測試，發(fā)現(xiàn)20 g/kg為0.5%CMC-Na所能溶解粗提物的最大劑量。取昆明種小鼠36只，按體質(zhì)量隨機分為6組，每組6只，分別為溶劑對照組，鞍葉羊蹄甲粗提物20.0、13.3、8.9、5.9、3.9 g/kg 5個劑量組，劑間比為1∶1.5。實驗前12 h禁食不禁水，然后灌胃不同劑量的粗提物，溶劑對照組灌胃0.5%CMCNa，灌胃體積均為40 mL/kg，僅灌胃1次。灌胃后連續(xù)觀察14 d，期間稱量小鼠體質(zhì)量，同時觀察小鼠行為學表現(xiàn)。給藥后第14天，脫臼處死小鼠，取臟器，觀察有無病變。結果發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組比較，給予所有劑量的鞍葉羊蹄甲粗提物后，均未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，小鼠的體質(zhì)量、行為學及臟器均無異常。因此，擬采用最大給藥量法進行正式實驗。

2.2 正式實驗

2.2.1 分組及給藥 取昆明種小鼠40只，雌雄各半，按行為學數(shù)據(jù)和體質(zhì)量隨機分為2組，每組20只，分別為溶劑對照組和鞍葉羊蹄甲組。以40 mL/kg的最大給藥體積分別給溶劑對照組小鼠和鞍葉羊蹄甲組小鼠灌胃0.5%CMC-Na和20 g/kg的鞍葉羊蹄甲粗提物，僅灌胃1次，灌胃后連續(xù)觀察小鼠反應14 d。

2.2.2 指標測定 觀察并記錄動物的毒性反應，包括外觀體征，行為活動，精神狀態(tài)，食欲，大小便及顏色，被毛，膚色，呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有無異常分泌物等。于給藥前1 d，給藥后1、2、3、5、8、11、14 d稱量小鼠體質(zhì)量，并同時測試小鼠的行為學表現(xiàn)。行為學實驗具體為：（1）于自主活動儀記錄小鼠的“站立”次數(shù)（平行測2次取平均值）以反應小鼠自主活動次數(shù)。（2）于平衡木上測試小鼠通過平衡木的表現(xiàn)以反應小鼠的運動協(xié)調(diào)能力，評分標準：平穩(wěn)通過，1分；前肢或后肢滑落，2分；懸掛或抱住平衡木，3分；直接掉落，4分。（3）于疲勞轉(zhuǎn)棒儀記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒儀（30 r/min）上的停留時間以反應小鼠的抗疲勞能力。給藥14 d后，眼后靜脈叢取血，通過全自動動物血液細胞分析儀測定血液生化指標，然后脫臼處死小鼠，取臟器稱量，計算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)（%）=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；并取肝、腎、心、腦組織放入4%多聚甲醛中固定后送大理白族自治州人民醫(yī)院病理科進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察組織病理學變化。

2.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用（x±s）表示。計量資料用LSD法比較組間差異；計數(shù)資料用非參數(shù)秩和檢驗比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 鞍葉羊蹄甲對小鼠體質(zhì)量和一般表現(xiàn)的影響給予鞍葉羊蹄甲后，小鼠的一般表現(xiàn)，包括外觀、飲食、活動表現(xiàn)、分泌物等未見異常。與溶劑對照組相比，除了在給藥第14天鞍葉羊蹄甲組小鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余測量時間點鞍葉羊蹄甲組小鼠的體質(zhì)量均無顯著變化，說明鞍葉羊蹄甲對小鼠體質(zhì)量基本無影響。見表1。

表1 鞍葉羊蹄甲對小鼠體質(zhì)量的影響（x±s，n=20）

3.2 鞍葉羊蹄甲對小鼠行為學的影響本實驗檢測的小鼠行為學主要包括自主活動、運動協(xié)調(diào)能力和抗疲勞能力，分別用自主活動次數(shù)、平衡木評分和在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上的停留時間評價。與溶劑對照組相比，給予鞍葉羊蹄甲1 d后，小鼠的自主活動次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余檢測時間點小鼠的自主活動次數(shù)無顯著變化；小鼠的平衡木評分以及在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上的停留時間無顯著差異。說明剛開始給予鞍葉羊蹄甲時會對小鼠的自主活動產(chǎn)生一定的抑制作用，除此外，鞍葉羊蹄甲不會對小鼠的行為學表現(xiàn)產(chǎn)生影響。見表2。

表2 鞍葉羊蹄甲對小鼠行為學的影響（x±s，n=20）

3.3 鞍葉羊蹄甲對小鼠臟器指數(shù)和主要血液生化指標的影響與溶劑對照組相比，鞍葉羊蹄甲組小鼠的臟器指數(shù)和主要血液生化指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明鞍葉羊蹄甲對小鼠的主要臟器和血液指標無明顯影響。見表3～4。

表3 鞍葉羊蹄甲對小鼠臟器指數(shù)的影響（x±s，n=20）

3.4 鞍葉羊蹄甲對小鼠臟器組織的影響臟器組織切片HE染色結果見圖1。與溶劑對照組相比，鞍葉羊蹄甲組小鼠的肝、腎、心、腦未見明顯病理變化，進一步說明鞍葉羊蹄甲對小鼠臟器無明顯毒副作用。

表4 鞍葉羊蹄甲對小鼠主要血液生化指標的影響（x±s，n=20）

圖1 鞍葉羊蹄甲對小鼠臟器組織的影響（×400，標尺為50μm）

4 討論

本研究通過預實驗發(fā)現(xiàn)最大給藥量的鞍葉羊蹄甲未造成小鼠死亡，因此采用最大給藥量法評估鞍葉羊蹄甲對小鼠的急性毒性作用。結果表明：20 g/kg的鞍葉羊蹄甲基本沒有急性毒性作用。首先，鞍葉羊蹄甲對小鼠的進食無明顯影響，與溶劑對照組相比，僅在第14天時鞍葉羊蹄甲組小鼠體質(zhì)量有所降低，其余時間段內(nèi)體質(zhì)量差異不明顯。其次，鞍葉羊蹄甲對主要臟器無明顯的毒副作用，無論是臟器指數(shù)還是臟器組織切片均未見顯著變化。鞍葉羊蹄甲對主要的血液生化指標也沒有明顯的影響，說明其對小鼠的運送氧氣功能、免疫功能無顯著毒性，但要注意鞍葉羊蹄甲能一定程度地升高小鼠的血小板計數(shù)，盡管差異無統(tǒng)計學意義，還是需要在用藥后密切注意其可能的促血栓作用〔5〕。由于鞍葉羊蹄甲可能通過外周抗炎起鎮(zhèn)痛作用，其與非甾體抗炎藥對血小板的作用也需要做一定的比較。鞍葉羊蹄甲對于其余急性毒性指標，如外觀、活動、分泌物排泄等均沒有明顯影響，說明鞍葉羊蹄甲的安全性較高，對動物的主要臟器功能均相對安全。

鎮(zhèn)痛藥物普遍存在中樞毒性〔6〕，如阿片類藥物引起鎮(zhèn)靜、眩暈、肌肉痙攣、惡心嘔吐和成癮；非阿片類鎮(zhèn)痛藥物曲馬多引起中樞抑制和無力；治療胃腸絞痛的阿托品引起中樞興奮及隨后的中樞抑制；治療神經(jīng)痛藥物卡馬西平引起眩暈、共濟失調(diào)等。鞍葉羊蹄甲對中樞性疼痛也有一定的作用。因此，本研究著重考察了鞍葉羊蹄甲對中樞系統(tǒng)的影響，采用自主活動儀、平衡木和疲勞轉(zhuǎn)棒儀評價用藥后小鼠的自主活動、運動協(xié)調(diào)和平衡能力、抗疲勞和平衡控制能力。結果表明，鞍葉羊蹄甲不會影響小鼠的運動協(xié)調(diào)、平衡控制和抗疲勞能力，但是在用藥后第1天小鼠的自主活動次數(shù)顯著減少，并在觀察期間小鼠的自主活動均降低，說明鞍葉羊蹄甲有一定的中樞抑制效應，需要在用藥期間注意監(jiān)控。

20 g/kg的鞍葉羊蹄甲換算為成年人（60 kg）的用量約為1 320 g生藥（按小鼠劑量折算系數(shù)為1，人劑量系數(shù)折算為0.11〔7〕31，生藥到凍干粉提取率為10%計算），在實際用藥中無法達到，因此，總體而言，治療劑量的鞍葉羊蹄甲（長期毒性實驗的低劑量一般設計為最大耐受量的1/10〔7〕112，這里假定治療量為最大耐受量的1/20，即1 g/kg）基本無急性毒性。由于鞍葉羊蹄甲主要用于慢性疼痛，如炎性疼痛和神經(jīng)痛，其長期毒性需要進一步的研究來評估。