何貴新，馮雨菲，秦偉彬，林 琳，胡夢弦，鄭國坤，玉黎燕，甲子永，韋 娟，文 琦

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是全球范圍內(nèi)發(fā)病、住院和死亡的最常見原因之一。目前，冠狀動脈重建術(shù)如經(jīng)皮冠狀動脈介入、冠狀動脈旁路手術(shù)、經(jīng)皮穿刺部位的選擇和輔助抗栓治療是提高AMI 臨床生存率最有效的策略。然而，再灌注治療是一把雙刃劍，恢復(fù)缺血心肌血流的過程可能導(dǎo)致心肌再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），隨著氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、自噬和炎性細(xì)胞因子的釋放等多種病理過程相互影響，可進一步加重心肌損害。相關(guān)動物模型研究表明，AMI 后的心肌損傷是缺血和再灌注損傷共同引發(fā)的，其中再灌注損傷引發(fā)的梗死面積占心肌梗死最終大小的50%［1］。故探究心肌缺血再灌注損傷的潛在分子機制，尋找減少最終梗死面積的治療策略是心血管領(lǐng)域急需解決的問題。近年來，多項研究證實線粒體ATP 敏感性鉀通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP）的激活在心肌保護中發(fā)揮作用，一方面，該通道本身可防止減少鈣攝取的驅(qū)動力，防止線粒體過渡膜孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的形成和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生以抵抗心肌缺血［2］，另一方面，可影響內(nèi)源性活性物質(zhì)及下游信號通路以發(fā)揮保護作用［3］。因此，激活mitoKATP 通道是藥物改善心肌損傷保護心肌細(xì)胞的重要途徑。有研究表明，復(fù)方制劑芪參益氣滴丸具有抗血小板聚集、促進血管新生、抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊和抑制氧化應(yīng)激等作用，從而發(fā)揮其活血化瘀通絡(luò)的功能，緩解MIRI 后的心肌損傷。筆者團隊前期通過動物實驗證實參益氣滴丸可以激活PI3K/AKT 信號，調(diào)控p-AKT 蛋白的表達，對MIRI 的具有改善心臟功能，保護心肌細(xì)胞的作用［4，5］。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，采用血清藥理學(xué)方法制備芪參益氣滴丸含藥血清，體外檢測芪參益氣滴丸含藥血清的心肌細(xì)胞的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

大鼠H9C2 心肌細(xì)胞系購買于浙江美森細(xì)胞科技有限公司。

1.2 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠20 只，8～10 周齡，體重220～250 g，實驗動物均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0014。飼養(yǎng)條件：溫度：（22±2）℃；濕度：40%～60%；光照周期：12 /12 h，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食進水；實驗流程嚴(yán)格遵循美國衛(wèi)生機構(gòu)發(fā)布的《實驗動物保護和應(yīng)用指南》，實驗操作嚴(yán)格遵守廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗管理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.3 實驗藥物

芪參益氣滴丸（丹參、三七、降香、黃芪，0.5 g/袋；天力士醫(yī)藥公司，國藥準(zhǔn)字：Z20030319，批號，180615）。

1.4 主要試劑

DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清（Hyclone），青鏈雙抗（上海生工），H2O2（分析純，天津市江天化學(xué)試劑廠），PI3K/AKT 信號通路阻斷劑wort（MCE，HY-10197），mitoKATP 特異性阻斷劑5-HD（abcam，ab141672），BCA 蛋白定量試劑盒（Biosharp，BL521A），抗AKT 抗體、抗p-AKT 抗體（美國cell signaling technology 公司），兔抗GAPDH、山羊兔二抗IgG（美國Proteintech 公司），蛋白預(yù)染Marker（美國Thermo Scientific 公司），30%丙烯酰胺（29∶1）（Amresco）1.5 mol/L Tris-HCl，pH=8.8 電泳緩沖液、1.0 mol/L Tris-HCl，pH=6.8 電泳緩沖液（無錫菩禾），10% SDS、10%過硫酸銨、麗春紅S（國藥），TEMED（Sigma），4×蛋白上樣緩沖液（無錫菩禾）蛋白預(yù)染Marker（Thermo），PVDF 膜（Millipore），5%的BSA（Amresco），PBS 磷酸鹽緩沖液（無錫菩禾），Tween-20（Amresco），ECL 發(fā)光液（七海生物），HRP 標(biāo)記二抗（中杉金橋）。

1.5 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 8000），光學(xué)顯微鏡（XDS-1A），倒置拍照顯微鏡（OLYMPUS，IX71），離心機（德國Eppendorf 公司），酶標(biāo)儀（Thermo，MK3），冷凍離心機（Effendorf），電泳儀（BIORAD，mini protean 3 cell），電轉(zhuǎn)儀（PS-9，大連競邁科技有限公司），移液器（Thermo），水浴鍋（Leica，HI1210），一體式化學(xué)發(fā)光成像儀（ChemiScope 5300 Pro），膜片鉗放大器AXON200B、Pclam6.0 數(shù)據(jù)采集軟件（AXON 公司）。

1.6 方法

1.6.1 含藥血清制備 20 只SPF 級雄性SD 大鼠，正常喂養(yǎng)3 d 后按隨機數(shù)表法分為2 組，即空白血清組及含藥血清組。芪參益氣滴丸給藥劑量參照《中藥藥理研究方法學(xué)》體表面積折算［6］，大鼠和人（人體質(zhì)量按照70 kg 計算）的等效劑量比值為6.3，成人芪參益氣滴丸用法是1 g，tid，根據(jù)公式計算出其每日的芪參益氣滴丸用量為27 mg/（100 g·d）。按照體重，含藥血清組予27 mg/100 g 芪參益氣滴丸溶于2 mL/100 g 生理鹽水，空白血清組予2 mL/100 g生理鹽水，每日早晚各灌胃1 次，連續(xù)7 d。末次給藥2 h 后，采用腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置30 min，予3 000 r/min，離心15 min 后取上清液。56 ℃、30 min 水浴滅活，0.22 μm 微孔濾膜濾過除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 取出液氮罐中凍存的H9C2 的心肌細(xì)胞，置入37 ℃水浴箱迅速搖晃使其溶解，將溶解凍存液中的細(xì)胞懸液吸至離心管中，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，用DMEM 培養(yǎng)基清洗1～2 次。將心肌細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1～2 d 換1 次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.6.3 含藥血清濃度的確定 待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h；將H9C2 心肌細(xì)胞隨機分為空白血清組、2.5% 含藥血清組、5.0% 含藥血清組、10.0%含藥血清組及15.0%含藥血清組，制備的含藥血清分別按2.5%、5.0%、10.0%、15.0%的比例與DMEM 高糖培養(yǎng)基混合，分組處理H9C2 細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，確認(rèn)最佳含藥血清濃度。

1.6.4 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型制備及分組給藥 按參考文獻［7］模型制備方法，待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μ L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；將H2O2加入DMEM 高塘培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μ mol/L，分組處理H9C2 細(xì)胞，3、8、16 h 后顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，確定H2O2最佳作用濃度和作用時間。

將H9C2 心肌細(xì)胞按隨機數(shù)字表法分為5 組，A：H9C2 細(xì)胞組，B：H9C2 細(xì)胞+H2O2模型組，C：H9C2 細(xì)胞+H2O2模型+芪參益氣組，D：H9C2細(xì)胞+H2O2模型+芪參益氣+PI3K/AKT 信號通路阻斷劑（wort）組，E：H9C2 細(xì)胞+H2O2模型+芪參益氣+mitoKATP 特異性阻斷劑（5-HD）組。按照上述分組處理細(xì)胞，A 組在空白血清培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)32 h，B 組在空白血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h 后，在培養(yǎng)液中加入H2O2（250 μmol/L）8 h 后收樣進行后續(xù)實驗；C 組予含藥血清處理24 h 后，進行H2O2（250 μmol/L）模型處理，8 h 后收樣進行后續(xù)實驗。其中D 組、E 組在含藥血清處理23 h 后，分別向培養(yǎng)基中加入wort、5-HD 使其終濃度為100 nmol/L、100 μmol/L，1 h 后再進行H2O2處理，方法同B 組。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞活性 將濃度為1×105cells/mL 的心肌細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，使每孔細(xì)胞數(shù)目為1×104個，然后將96 孔板放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；將處理后的心肌細(xì)胞按照CCK-8 試劑盒的操作說明，斜貼孔壁向孔中加10 μL 的CCK-8 溶液，注意避免產(chǎn)生氣泡，將孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測每個孔在450 nm 波長處的OD 值，計算各組的H9C2 細(xì)胞存活率。每組設(shè)置6 個復(fù)孔進行實驗。

1.7.2 Western blot 法檢測各組H9C2 心肌細(xì)胞p-AKT、AKT 的表達水平 收集需要抽提蛋白的細(xì)胞用適量預(yù)冷的已加PMSF的RIPA裂解液混勻，充分裂解后12 000 r/min離心10 min，收集上清。BCA蛋白定量試劑盒確定蛋白濃度，根據(jù)樣品濃度確定上樣量。制備蛋白樣品及聚丙烯酰胺凝膠，裝好電泳裝置，倒入電泳緩沖液，分別注入蛋白樣品和maker，進行SDS-PAGE 電泳。待蛋白分離后，將膠小心的移入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，在轉(zhuǎn)膜裝置上進行轉(zhuǎn)膜。麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，將膜用TBST 漂洗3 次，每次5 min，然后用5%的脫脂奶粉37 ℃緩慢震蕩2 h。根據(jù)說明書，用封閉液稀釋AKT，p-AKT 抗體至合適濃度，4 ℃過夜孵育。用TBST 洗滌孵育一抗的膜，3 次，每次5 min。隨后根據(jù)用量，按照說明書稀釋HRP 標(biāo)記的兔二抗/小鼠二抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST 洗滌后，一體式化學(xué)發(fā)光儀檢測。

1.7.3 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測KATP 通道電流

1.7.3.1 溶液配制 記錄KATP 通道電流的細(xì)胞外液配制（mmol/L）：NaCl 137 g、CaCl 1.2 g、KCl 5.0 g、MgSO41.2 g、NaH2PO40.5 g、葡萄糖 10 g、HEPES 10 g（用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.35～7.40）；記錄KATP 通道電流的細(xì)胞內(nèi)液配制（mmol/L）：NaCl 10 g、CaCl 1 g、KCl 125 g、MgATP 1 g、HEPES 10 g、EGTA 14 g（用KOH 調(diào)節(jié)pH 至7.1）。

1.7.3.2 膜片鉗全細(xì)胞記錄 將復(fù)鈣后的H9C2 心肌細(xì)胞懸液滴入灌流槽中，置于倒置顯微鏡工作臺上，待細(xì)胞貼壁后使用細(xì)胞外液灌流沖洗，在顯微鏡下選取貼壁牢固，邊緣整齊，形態(tài)規(guī)整、橫紋清晰，無自主收縮的細(xì)胞進行膜片鉗實驗；通過注射器給玻璃微電極充灌電極內(nèi)液，使電極電阻為3～5 Ω。給予適當(dāng)負(fù)壓吸引，通過調(diào)節(jié)顯微鏡焦距及操作儀使電極與細(xì)胞表面不斷靠近，最終充分接觸，形成高阻封接，電阻值達到GΩ 以上，繼續(xù)加大負(fù)壓破膜，給予電容及串聯(lián)電阻補償，此時形成全細(xì)胞記錄模式；將各組干預(yù)藥物分別加入灌流槽中，待反應(yīng)10～15 min 后進行電流記錄。電流信號經(jīng)Ag/AgCl 電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 200B 放大器放大，電流的記錄采用電壓鉗制方式，數(shù)據(jù)的采集及分析處理由Pclamp 6.0 軟件完成。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較若方差齊時采用單因素方差分析（ANOVA），方差不齊采用非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最佳含藥血清濃度確定

實驗結(jié)果顯示，當(dāng)含藥血清加入比例為2.5%、5.0%、10.0%時，細(xì)胞狀態(tài)良好，當(dāng)含藥血清濃度為15.0%時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差，所以為了保證藥效和兼顧細(xì)胞狀態(tài)，所以后期選擇10.0%的含藥血清濃度用于實驗，見圖1。

圖1 不同濃度含藥血清對細(xì)胞形態(tài)的影響Fig 1 Effects of different concentrations of drug-containing serum on cell morphology

2.2 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型制備中最佳H2O2 濃度及作用時間確定

實驗結(jié)果顯示，當(dāng)H2O2只作用3 h 時，不管何種濃度對細(xì)胞均沒有顯著性的氧化損傷；作用8 h，當(dāng)濃度為250 μmol/L時，對H9C2 細(xì)胞有顯著的氧化損傷作用，當(dāng)濃度增加或者作用時間延長至16 h時，細(xì)胞狀態(tài)很差，不適合用于后期實驗，所以選擇250 μ mol/L的H2O2作用8 h 用于后期的實驗，見圖2。

圖2 不同濃度及作用時間的H2O2對H9C2 心肌細(xì)胞的氧化損傷作用Fig 2 Oxidative damage of H2O2 at different concentrations and time of action on H9C2 cardiomyocytes

2.3 各組H9C2 心肌細(xì)胞活性的變化

CCK-8 結(jié)果顯示，與A 組相比，B 組心肌細(xì)胞活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與B組心肌細(xì)胞相比，加入芪參益氣滴丸的C 組心肌細(xì)胞活性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與C組相比，D 組和E 組心肌細(xì)胞活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞活性（n=6，±s）Tab 1 Myocardial cell activity in each group（n=6，±s）

表1 各組心肌細(xì)胞活性（n=6，±s）Tab 1 Myocardial cell activity in each group（n=6，±s）

注：與A 組相比，**P＜0.001；與B 組相比，◆◆P＜0.001；與C 組相比，▲P＜0.01，▲▲P＜0.001。

OD 值0.935±0.047 0.375±0.075**0.743±0.051◆◆0.529±0.068▲▲0.625±0.033▲83.609＜0.001組別A:H9C2 組B:H9C2+H2O2模型組C:H9C2+H2O2模型組+芪參益氣組D:H9C2+H2O2模型組+芪參益氣+wort 組E:H9C2+H2O2模型組+芪參益氣+5-HD 組FP

2.4 各組H9C2 心肌細(xì)胞p-AKT、AKT 的表達水平

Western blot 結(jié)果表示各組間AKT 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與A 組相比，B、C、D、E組p-AKT 蛋白表達顯著降低，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；而與B 組相比，C、D、E 組p-AKT蛋白表達顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖3，表2。

表2 各組心肌細(xì)胞AKT 及p-AKT 蛋白相對表達量比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of the relative expression levels of AKT and p-Akt protein in cardiomyocytes of each group（n=3，±s）

注：與A 組比較,**P＜0.001;與B 組比較，##P＜0.001。

組別A：H9C2 組B：H9C2+H2O2模型組C：H9C2+H2O2模型+芪參益氣組D：H9C2+H2O2模型+芪參益氣+wort 組E：H9C2+H2O2模型+芪參益氣+5-HD 組FP p-AKT 1.00±0.37 0.24±0.03**0.62±0.01**##0.40±0.01**##0.58±0.35**##306.165＜0.001 AKT 1.00±0.02 1.03±0.05 1.01±0.05 1.02±0.03 0.99±0.05 0.53 0.72

2.5 全細(xì)胞膜片鉗實驗

正常狀態(tài)下，H9C2 心肌細(xì)胞KATP 通道是不開放的，因此，將細(xì)胞膜電位鉗置于-40 mV，給予從-80～60 mV 的斜坡刺激誘發(fā)背景電流。在0 mV 測試電壓下，與A 組心肌細(xì)胞相比，B 組心肌細(xì)胞外向電流顯著增加，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；而與B 組比較，C 組電流有進一步的增加趨勢，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），表明氧化損傷心肌細(xì)胞經(jīng)芪參益氣干預(yù)后，呈現(xiàn)明顯增強的外向電流。與C 組相比，D 組和E 組電流明顯降低，組間具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。提示PI3K/AKT 特異性阻斷劑和mitoKATP 特異性阻斷劑，均能不同程度地阻斷這部分電流。見表3。

表3 電壓0 mV 時各組心肌細(xì)胞mitoKATP 通道電流（n=10，±s）Tab 3 mitoKATP channel current of myocardial cells in each group at 0 mV voltage（n=10，±s）

表3 電壓0 mV 時各組心肌細(xì)胞mitoKATP 通道電流（n=10，±s）Tab 3 mitoKATP channel current of myocardial cells in each group at 0 mV voltage（n=10，±s）

注：與A 組相比，**P＜0.001；與B 組相比，◆◆P＜0.001；與C 組相比，▲▲P＜0.001。

0 mV (pA)73.35±8.16 226.30±22.70**332.8±10.46◆◆176.88±15.85▲▲141.23±10.63▲▲449.63＜0.001組別A:H9C2 組B:H9C2+H2O2模型組C:H9C2+H2O2模型組+芪參益氣組D:H9C2+H2O2模型組+芪參益氣+wort 組E:H9C2+H2O2模型組+芪參益氣+5-HD 組FP

以電流對電壓作圖，可得到心肌細(xì)胞KATP的電流-電壓關(guān)系曲線（Ⅰ～Ⅴ）。在0～20 mV 測試電壓范圍內(nèi)，外向電流顯著增強，各組電流曲線中后段抬高，與背景電流比較，高出的部分即為開放的KATP 通道電流。見圖4。

圖4 各組心肌細(xì)胞KATP 通道電流圖Fig 4 KATP channel currents of cardiomyocytes in each group

3 討論

目前，再灌注已被確定為缺血性心臟病的可行治療策略。然而，心肌組織供血不足后血流量的恢復(fù)通常導(dǎo)致心肌損傷的進一步加重。更嚴(yán)重的是，心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）可能產(chǎn)生嚴(yán)重的病理效應(yīng)，如ROS、氮類物質(zhì)過度生成，炎癥介質(zhì)釋放和招募增加，免疫細(xì)胞活化，引起心肌細(xì)胞凋亡或壞死，最終導(dǎo)致心肌損傷和功能障礙［8，9］。作為介入術(shù)后面臨的一種常見且不可避免的病理生理變化，MIRI 可導(dǎo)致心律失常、梗死面積擴大，是一種高發(fā)病率、高死亡率的疾病，且在年輕人中發(fā)病率呈上升趨勢。因此，如何減輕MIRI 造成的損害問題引起了心血管領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。盡管既往的研究部分揭示了MIRI 的分子機制，但MIRI 的具體機制仍不夠明確，有效防治迫在眉睫。

中國古籍中并無對缺血再灌注損傷的描述，可以認(rèn)為MIRI 是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展下的產(chǎn)物。根據(jù)再灌注治療后產(chǎn)生一系列心肌損傷的臨床表現(xiàn)，可將其歸納為“胸痹”“真心痛”范疇。目前，有關(guān)MIRI 的病因病機及辨證論治尚未形成統(tǒng)一的專家共識。李輝等［10］認(rèn)為MIRI 的發(fā)生以痰瘀痹阻心脈為基礎(chǔ)，陽衰陰盛，濁毒內(nèi)生，心之體絡(luò)受損為關(guān)鍵。何星靈等［11］認(rèn)為再灌注治療可復(fù)通血管，以活血化瘀通絡(luò)為主，當(dāng)屬“祛邪”治標(biāo)之法，然而“本虛”癥狀如短氣、乏力、眩暈等仍存在。曹蛟等［12］則強調(diào)MIRI 以陽氣虧虛為本，痰濁瘀血為標(biāo)，溫陽化氣，痰瘀同治則陽氣可復(fù)，脈道通暢。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香組成，是治療氣虛血瘀型胸痹的中藥復(fù)方制劑，廣泛用于臨床治療缺血性心衰、心絞痛等心血管疾病，以及心肌梗死的二級預(yù)防［13，14］。動物實驗表明，芪參益氣滴丸對CHF 大鼠有明顯的心肌保護作用，可能通過抑制TGF-β1/Smads 通路，增強心肌纖維化程度；同時抑制caspase-3 信號通路，改善心肌細(xì)胞凋亡，從而起到保護心肌的作用［15］。此外，芪參益氣滴丸可部分激活PI3K/Akt 信號通路，從而保護H9C2 細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的系列損傷［16］。臨床實驗證實芪參益氣滴丸能夠有效保護AMI 患者PCI 術(shù)后血管內(nèi)皮功能，減輕機體炎性反應(yīng)，有助于提高心臟功能，且安全性較高［17］。作為多通路、多靶點的中藥復(fù)方制劑，芪參益氣滴丸包含有機酸類、黃酮類、醌類、皂苷類、氨基酸以及其他類化合物共53 種化學(xué)成分，各種不同類別的藥物活性成分可通過協(xié)同作用共同對缺血/再灌注的心肌細(xì)胞起到保護作用。

本研究以芪參益氣滴丸為代表方，采用血清藥理學(xué)實驗方法，進一步探討中藥復(fù)方對MIRI 作用效果及可能機制。實驗通過SD 大鼠口服芪參益氣滴丸制備不同濃度的含藥血清，過觀察其對心肌細(xì)胞形態(tài)變化以確定最佳濃度，結(jié)果顯示10%為最佳含藥血清濃度。此外，以體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞為實驗對象，根據(jù)心臟在氧化損傷過程中氧化增強反應(yīng)的原理，選用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，以模擬缺氧/復(fù)氧病理模型。本實驗觀察結(jié)果提示250 μmol/L 的H2O2預(yù)處理8 h 后，損傷作用作用最顯著，可用于后期細(xì)胞實驗。

MIRI 是多因素參與的復(fù)雜病理生理過程，涉及多種機制及信號通路，其中細(xì)胞調(diào)亡是心肌損傷的關(guān)鍵因素，決定心功能和預(yù)后。本研究采用CCK-8法檢測心肌細(xì)胞存活率，結(jié)果提示芪參益氣滴丸含藥血清可顯著提高氧化損傷后H9C2 心肌細(xì)胞的存活率，具有一定的心肌細(xì)胞保護作用。PI3K 及其下游靶絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT 屬于一個保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶家族，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程［18］。PI3K/AKT 信號通路被認(rèn)為是一種內(nèi)源性負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，在應(yīng)對有害的外部刺激時促進細(xì)胞存活，在MIRI 的病理進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。其中，AKT 的活化形式，即p-AKT 可調(diào)節(jié)大量凋亡相關(guān)介質(zhì)，例如，當(dāng)p-AKT 被激活時，p-AKT 通過Bcl2家族成員（Bcl2，Bclxl，Bax 和Bad）作用于固有的細(xì)胞死亡通路，以及通過caspase 家族成員（cleaved caspase 3，caspase 8 和caspase 9）作用于外部的細(xì)胞死亡通路［20］。本研究結(jié)果提示，芪參益氣滴丸含藥血清明顯激活氧化損傷心肌細(xì)胞中p-AKT 蛋白的表達，而加入PI3K/AKT 抑制劑的心肌細(xì)胞中，p-AKT 蛋白表達下降，同時心肌細(xì)胞的活性也相對減少，表明芪參益氣滴丸可干預(yù)PI3K/AKT 信號通路中p-AKT 蛋白的表達，同時增加心肌細(xì)胞活性。

ATP 敏感性鉀通道（KATP 通道）是一種由細(xì)胞內(nèi)ATP 濃度所調(diào)控的內(nèi)向整流鉀離子通道［21］。Tinker 等［22］研究發(fā)現(xiàn)KATP 通道大量存在于心房、心室、房室傳導(dǎo)系統(tǒng)等心臟組織當(dāng)中，其不僅能夠改善心肌細(xì)胞的缺血預(yù)適應(yīng)，也在心肌細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，在抵抗MIRI 的過程中扮演著十分重要的角色。Penna 等［23］認(rèn)為，激活KATP通道能夠減少心肌細(xì)胞在各種應(yīng)激狀態(tài)下的損傷和凋亡。KATP 通道的活力由細(xì)胞內(nèi)的KATP 通道數(shù)量和開放程度共同決定，其活動與細(xì)胞代謝密切相關(guān)，并受到細(xì)胞內(nèi)ATP 濃度的調(diào)節(jié)：在生理情況下，ATP 在細(xì)胞內(nèi)具有較高濃度，此時KATP 通道受到抑制而關(guān)閉；而當(dāng)心肌細(xì)胞受到缺血、再灌注損傷和細(xì)胞凋亡等病理刺激時，細(xì)胞內(nèi)的ATP 會被消耗，濃度降低，此時KATP 通道不再受到抑制，導(dǎo)致ATP 通道開放，鉀離子外流，細(xì)胞膜的靜息電位降低，動作電位縮短，鈣離子的內(nèi)流減少，心肌細(xì)胞的鈣超載減輕［24］，從而降低心肌細(xì)胞的耗能，增加其應(yīng)激耐受性，起到保護心肌的作用［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷后，細(xì)胞外向電流顯著增加，從而產(chǎn)生應(yīng)激的心肌保護作用；在氧化損傷的基礎(chǔ)上給予芪參益氣干預(yù)后，心肌細(xì)胞電流明顯增加，與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)加入mito-KATP 特異性阻斷劑5-HD 后，電流被部分阻斷，表明該電流的產(chǎn)生與mitoKATP 通道激活密切相關(guān)，推測芪參益氣滴丸可能具有KATP 通道開放劑樣作用。此外，加入阻斷劑的心肌細(xì)胞活性較芪參益氣滴丸干預(yù)組顯著下降，表明mitoKATP 通道的開放可能對心肌細(xì)胞的具有保護作用。

綜上所述，本實驗證實芪參益氣滴丸通過激活H9C2 心肌細(xì)胞中p-AKT 蛋白的表達及KATP 通道的開放，從而對心肌細(xì)胞起到保護作用。但芪參益氣滴丸的具體機制及相關(guān)聯(lián)級反應(yīng)尚未探討，需要進行進一步的實驗以明確其機制。