張穎穎，康超娣，張明悅，王娟強(qiáng)，趙文濤，李瑩瑩

（北京食品科學(xué)研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

結(jié)合現(xiàn)代分析手段的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠分析復(fù)雜生物樣本中存在的數(shù)千種蛋白及多肽[1]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)主要以尋找多肽標(biāo)記物為目標(biāo)[2]，借助當(dāng)前的質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)手段，通過篩選、鑒別、驗(yàn)證等步驟，獲得物種、組織和/或蛋白質(zhì)中的特異性肽段，在食品真實(shí)性分析、產(chǎn)地溯源、生物醫(yī)藥等方面開辟了新的研究領(lǐng)域[3-4]（圖1）。

肉類摻假是全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題[5]，不僅影響肉類行業(yè)的健康發(fā)展，侵犯消費(fèi)者的權(quán)益，而且還會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康[6]、飲食[7]、宗教[8]及生活方式等方面產(chǎn)生一系列的影響；因此，建立快速、高效、準(zhǔn)確的肉類摻假鑒別技術(shù)對(duì)于保障肉品真實(shí)性顯得尤為重要。目前，常見的肉類真實(shí)性鑒別方法主要是以DNA和蛋白質(zhì)（或多肽）為分析對(duì)象的檢測(cè)方法?；贒NA的檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、基因測(cè)序技術(shù)、基因芯片技術(shù)等，基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和質(zhì)譜技術(shù)等。其中，PCR技術(shù)易受DNA降解和復(fù)雜基質(zhì)的影響[9-10]；ELISA技術(shù)易出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性以及熱加工肉制品蛋白易變性等問題[11-12]，而基于蛋白質(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜技術(shù)能有效地避免上述檢測(cè)技術(shù)的弊端，尤其是在應(yīng)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)干擾和假陽性方面表現(xiàn)出較高的靈敏度及準(zhǔn)確性。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐漸被應(yīng)用于肉類食品的真實(shí)性鑒別領(lǐng)域[13]。本文綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類食品真實(shí)性鑒別中的研究進(jìn)展，以期為肉類食品質(zhì)量安全控制提供新思路。

圖1 基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域Fig. 1 Fields of application of proteomics based on mass spectrometry

1 蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類真實(shí)性鑒別領(lǐng)域的主要研究方法

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究流程

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究流程主要包括樣品的前處理、多肽分離、多肽標(biāo)記物的篩選及鑒別[14]。圖2總結(jié)了當(dāng)前在真實(shí)性鑒別研究領(lǐng)域中基于蛋白質(zhì)組學(xué)方法的基本分析流程。根據(jù)不同的分析技術(shù)及酶解方式，可分為3 種分析流程。第一種是蛋白質(zhì)先經(jīng)雙向凝膠電泳（twodimensional gel electrophoresis，2-DE）分離后，目標(biāo)蛋白質(zhì)在膠內(nèi)酶解成多肽，經(jīng)質(zhì)譜分析，得到多肽質(zhì)量指紋圖譜（peptide mass fingerprint，PMF）；第二種是蛋白質(zhì)提取液直接酶解成肽段，經(jīng)質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)，結(jié)合專業(yè)軟件分析譜圖可獲得蛋白及多肽信息；第三種是樣品用溶劑提取后無需酶解，采用互補(bǔ)沉淀和色譜技術(shù)等多種手段相結(jié)合的方法分離多肽，再經(jīng)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肽段進(jìn)行分析鑒定。其中，第二種方法由于前處理過程相對(duì)簡便，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，從而獲得更多青睞。

圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究流程分析圖Fig. 2 Analytical workflow for proteomics

1.2 物種特異性多肽的篩選

1.2.1 物種特異性多肽的提取

找尋物種的靶標(biāo)多肽是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，但肉制品加工方式多樣，基質(zhì)十分復(fù)雜，目標(biāo)多肽濃度范圍寬泛，因此選擇適宜的提取方式至關(guān)重要。

目前，常用的提取方式主要包括將樣品與含有不同添加物（pH值調(diào)節(jié)劑、還原劑、烷基化試劑）的提取緩沖液，采用均質(zhì)混勻、劇烈振蕩/渦旋，或是采用超聲波技術(shù)[15-16]等方式輔助以提取多肽。為了提高多肽的提取率，von Bargen等[17]評(píng)估了11 種提取緩沖溶液，并結(jié)合了不同的提取方式（劇烈振蕩/渦旋/均質(zhì)機(jī)均質(zhì)），以研究蛋白提取效率，在這項(xiàng)研究中，采用6 mol/L尿素、1 mol/L硫脲和50 mmol/L Tris-HCl的提取緩沖液（pH 6）得到最佳的蛋白提取效果。在提取過程中，為降低樣品的復(fù)雜性，研究人員提出了分級(jí)分離方法[18-20]，其中，2-DE是公認(rèn)的蛋白分離效率較高的分離技術(shù)，在肉類真實(shí)性鑒別研究中，主要用于分離蛋白，便于后續(xù)膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜分析，該方法易實(shí)現(xiàn)不同肉類中單一蛋白的多肽組成分析，從而能夠找出該蛋白的多肽序列在不同物種中的差異，利用這些差異性的肽段實(shí)現(xiàn)對(duì)不同肉類的真實(shí)性鑒定[20]。Montowska等[21]采用2-DE技術(shù)對(duì)豬肉、牛肉、雞肉、火雞肉、鴨肉和鵝肉及其肉制品中的肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同加工工藝處理后的肉及肉制品中均觀察到MLC的物種間特異性。但電泳技術(shù)仍存在一些局限性，如疏水性、難溶性蛋白質(zhì)及低豐度蛋白質(zhì)的分離效果差、動(dòng)態(tài)范圍有限、加工引起的蛋白質(zhì)降解及膠內(nèi)酶解過程較長等。部分實(shí)驗(yàn)采取選擇性沉淀[22-23]方法進(jìn)行蛋白純化，常用的溶劑包括乙腈、丙酮、甲醇、三氯乙酸等，該方法具有快速、簡單、成本低的優(yōu)勢(shì)，但高濃度試劑易使酶和具有活性的蛋白變性；因此，在酶解之前還需使用其他手段去除溶劑。Sarah等[23]通過丙酮沉淀法處理熱加工豬肉制品以達(dá)到凈化樣品的目的。為了實(shí)現(xiàn)快速對(duì)樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b別，一些研究人員提出了一種無需蛋白質(zhì)分離和純化的提取方法[24]。Montowska等[25]將洗凈的肉類加工樣品在100 mmol/L碳酸氫銨溶液中均質(zhì)，經(jīng)真空濃縮器干燥后溶于50 mmol/L碳酸氫銨溶液中以進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解。Prandi等[24]將均質(zhì)的肉制品凍干后，溶解于50 mmol/L碳酸氫銨溶液中，經(jīng)還原及烷基化，在含有胰蛋白酶的碳酸氫銨溶液中酶解18 h（37 ℃），最后采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析。該處理過程操作相對(duì)簡便，樣品經(jīng)提取、酶解后，采用液相色譜技術(shù)分離后直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析，縮短了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，被廣泛應(yīng)用于食品真實(shí)性鑒定過程中。

1.2.2 物種特異性多肽數(shù)據(jù)的采集

樣品提取后，利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析，應(yīng)用較多的儀器包括飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flight mass，TOF-MS）、軌道離子阱質(zhì)譜（Orbitrap）等高分辨率質(zhì)譜儀，正離子模式掃描，采用全掃描-二級(jí)掃描結(jié)合的模式，可高精度地測(cè)定多肽分子質(zhì)量，再通過組學(xué)軟件分析，搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒別多肽的蛋白及物種來源。TOF-MS通過靜電場加速離子后，以離子飛行速度差來分析離子質(zhì)核比；該類儀器可檢測(cè)的分子質(zhì)量范圍寬、掃描速度快、儀器結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格相對(duì)便宜；但其存在分辨率較低、受環(huán)境影響較大、需要實(shí)時(shí)校正等不足。軌道離子阱質(zhì)譜是離子繞紡錘體進(jìn)行軸向及徑向運(yùn)動(dòng)，通過傅里葉轉(zhuǎn)換得到頻譜圖，而離子共振頻率與質(zhì)核比相關(guān)，最終得到質(zhì)譜圖；相比TOF-MS而言，軌道離子阱質(zhì)譜的分辨率高，質(zhì)量軸相對(duì)穩(wěn)定；但其掃描時(shí)間較長，分子質(zhì)量范圍較窄，價(jià)格較貴。相對(duì)于高分辨質(zhì)譜而言，三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜屬于低分辨質(zhì)譜儀，但其MRM模式通過同時(shí)驗(yàn)證待測(cè)物的母離子及子離子信息，可大大降低基質(zhì)干擾效應(yīng)，提高定性及定量的準(zhǔn)確性，應(yīng)用性更廣。因此，越來越多的研究傾向于先利用高分辨質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)并經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索得到物種差異性多肽序列；然后將篩選的多肽信息進(jìn)行轉(zhuǎn)換并導(dǎo)入至低分辨率質(zhì)譜中進(jìn)行樣品分析測(cè)定。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)前，常使用液相色譜技術(shù)進(jìn)行組分分離，從而得到較高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，如納升液相色譜（nano liquid chromatography，nLC）、超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）。相比UPLC，nLC具有更高的耐壓性，可以選擇更長的色譜柱或是粒徑更小的色譜柱，通過較小的流速，從而實(shí)現(xiàn)高效的分離度及重復(fù)性；但其分析時(shí)間較長，通常需要20多小時(shí)甚至更長的時(shí)間，而UPLC通常在1 h之內(nèi)完成整個(gè)分析過程。對(duì)于食品分析而言，食品基質(zhì)較為豐富，且篩選差異多肽的蛋白來源基本上都是高峰度蛋白，采用UPLC技術(shù)能夠滿足一般的蛋白組學(xué)需求；而對(duì)于需要盡可能多的得到蛋白及多肽信息，并且需要達(dá)到實(shí)驗(yàn)的高重復(fù)性，可以采用nLC技術(shù)。表1列舉了質(zhì)譜技術(shù)在肉及肉制品中物種源性鑒別方面的研究。

此外，還可以采用基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）與TOF-MS結(jié)合的方式，基于特定波長的激光照射的軟電離技術(shù)，使得多肽帶單一電荷，不會(huì)產(chǎn)生明顯的碎片離子，從而得到相對(duì)簡單的質(zhì)譜圖，該方法靈敏度高，并且對(duì)樣品的前處理過程要求不嚴(yán)，從而簡化了樣品處理過程。如Flaudrops等[39]采用MALDI-TOF-MS技術(shù)分析明膠樣品，實(shí)現(xiàn)了豬肉、牛肉明膠物種來源的區(qū)分。該技術(shù)也存在一系列缺點(diǎn)，尤其是當(dāng)一個(gè)點(diǎn)中存在多個(gè)蛋白時(shí)，MALDI-TOF-MS的重復(fù)性不高，結(jié)果可靠性低；此外，MALDI-TOF-MS也不能進(jìn)行翻譯后修飾蛋白質(zhì)的分析。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，LESA-MS由于檢測(cè)時(shí)間短受到關(guān)注。LESA-MS是基于芯片的納米電噴霧離子化質(zhì)譜分析技術(shù)，通過樣品表面的萃取溶液形成液體或表面微接點(diǎn)以提取分析物[40]，是一種快速、高通量的質(zhì)譜分析方法，并已應(yīng)用于牛肉、豬肉、馬和家禽等各種加工肉制品中的真實(shí)性鑒定中[25-26]。Montowska等[26]提出利用LESA-MS技術(shù)鑒別不同類型加工肉制品（牛肉、豬肉、馬、雞肉和火雞肉），篩選出25 條熱穩(wěn)定性多肽。但LESA-MS對(duì)于低峰度蛋白的鑒定以及定量分析等仍處于探索階段。

質(zhì)譜在對(duì)多肽進(jìn)行解析的過程中主要采用兩種模式，分別是數(shù)據(jù)依賴采集模式（data-dependent analysis，DDA）和數(shù)據(jù)非依賴采集模式（data-independent analysis，DIA）。DDA是質(zhì)譜采集過程中，在每一個(gè)循環(huán)中分別在一級(jí)譜圖中挑選響應(yīng)值比較高的離子進(jìn)行二級(jí)掃描，并將得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的理論蛋白譜圖進(jìn)行匹配。DDA模式簡單有效，分析流程比較成熟，能夠減少干擾離子的影響，從而提供較高水平的譜圖信息，是目前質(zhì)譜分析的主流方式[41]。Montowska等[26]采用DDA模式獲取MS/MS數(shù)據(jù)，在牛肉、豬肉和馬肉中鑒定出了肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）異構(gòu)體的標(biāo)記多肽。但DDA模式也存在一些不足，即選擇離子具有一定的隨機(jī)性，偏向于檢測(cè)豐度較高的肽段，而抑制了低豐度肽段的檢測(cè)[42]；并且在分析復(fù)雜樣品時(shí)，樣品重復(fù)性較差。相較于DDA，DIA是近年來發(fā)展起來的一種技術(shù)，是將采集過程中的所有肽段按照質(zhì)核比分成若干段，再對(duì)每個(gè)窗口內(nèi)的所有一級(jí)離子進(jìn)行碎片化掃描，通過提取子離子信息進(jìn)行蛋白定量分析，該方法能夠避免DDA模式下一級(jí)離子選擇的隨機(jī)性，重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確，但該模式下不能直觀地指出子離子的來源，需通過相對(duì)專業(yè)的軟件進(jìn)行分析[43]。Gillet等[41]開發(fā)了

碎片離子連續(xù)窗口采集技術(shù)，使用Q-TOF在32 個(gè)連續(xù)的25 amu窗口檢測(cè)所有碎片離子譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在掃描中無法檢測(cè)到目標(biāo)肽的一級(jí)質(zhì)譜信息，但通過提取特定的碎片離子信息可以在超過4 個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)確定目標(biāo)肽。近年來，基于DIA模式的方法多集中于臨床醫(yī)學(xué)方向的應(yīng)用。Lin Lin等[44]基于DIA模式的MS方法對(duì)血清中獲得的多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，與DDA方法相比，優(yōu)化的DIA法檢測(cè)到的多肽和蛋白數(shù)量增加了一倍，重現(xiàn)性更好，單次運(yùn)行DIA分析可在50 min的梯度時(shí)間內(nèi)對(duì)300多種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，且無需蛋白預(yù)分離，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)與疾病相關(guān)的靶標(biāo)蛋白。

表1 基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類食品真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用Table 1 Application of proteomics based on mass spectrometry for meat product authentication

1.2.3 物種特異性多肽的鑒定和確認(rèn)

利用高分辨質(zhì)譜獲得多肽數(shù)據(jù)后，還需使用專業(yè)的軟件分析質(zhì)譜譜圖，目前收費(fèi)軟件包括Proteome Discoverer（美國Thermo公司）、Peaks Studio（美國BSI公司）、ProteinPilot（美國AB SCIEX公司）、Mascot（英國Matrix Science公司）等，免費(fèi)軟件主要有Maxquant。不同軟件之間通過整合不同的搜庫算法，在提取質(zhì)譜信息的同時(shí)，對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，從而獲得多肽及蛋白的匹配信息，常用的數(shù)據(jù)庫包括UniProt（http://www.uniprot.org）、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）等。UniProt被認(rèn)為是收錄最廣泛和注釋信息最全面的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，也是搜索蛋白相關(guān)信息的首推數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)主要來自于基因組測(cè)序項(xiàng)目后獲得的蛋白質(zhì)序列，也包含了大量來自文獻(xiàn)的蛋白質(zhì)生物功能信息。然而，經(jīng)蛋白組學(xué)軟件在默認(rèn)參數(shù)下搜庫得出的多肽及蛋白信息數(shù)量龐大，會(huì)影響后續(xù)多肽物種唯一性的篩選工作，因此需對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[45]，如序列覆蓋率、置信度、肽段長度和峰強(qiáng)度等參數(shù)，利用所選肽段的豐度，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并篩選差異多肽，然后通過BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）或FASTA（http://www.ebi.ac.uk/fasta）算法驗(yàn)證多肽的種屬特異性。Li Yingying等[31]利用Maxquant軟件提取質(zhì)譜譜圖并進(jìn)行UniProt數(shù)據(jù)庫搜索，通過對(duì)序列長度、序列覆蓋率等關(guān)鍵參數(shù)的設(shè)置，大大提高了特異性多肽的篩選速度和效率。Zhang Yingying等[45]通過Full MS/dd-MS2掃描模式得到樣品的多肽質(zhì)譜信息，利用Proteome Discoverer軟件對(duì)UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，結(jié)合SPSS軟件分析肽段的豐度并繪制PCA模型，同時(shí)優(yōu)化多肽篩選的關(guān)鍵參數(shù)（序列覆蓋率、置信度、肽長度和峰強(qiáng)度等），大大縮短了特異性多肽的篩選過程，隨后采用BLAST進(jìn)一步驗(yàn)證所選肽段的種屬唯一性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)豬、牛、羊、雞、鴨等動(dòng)物血豆腐的摻假鑒定。

1.2.4 物種特異性多肽的熱穩(wěn)定性考察

據(jù)報(bào)道，通過比較同物種加工前后特有多肽的響應(yīng)變化，發(fā)現(xiàn)部分多肽在高溫加工過程中的響應(yīng)值明顯下降[30,46]，這主要是因?yàn)闃悠方?jīng)熱加工處理后，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變性，進(jìn)而影響了蛋白的提取及酶解。因此，結(jié)合當(dāng)前食品加工的主要處理方式，進(jìn)一步考察多肽的熱穩(wěn)定性。Sarah等[23]從熱加工肉制品中篩選了豬肉的特異性肽段，設(shè)定了不同熱加工處理?xiàng)l件，100 ℃煮沸30 min、121 ℃高溫滅菌20 min，對(duì)多肽的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，在熟肉樣品中依然可以檢測(cè)到豬肉的特異性多肽標(biāo)志物。Wang Guiji等[30]也通過設(shè)置不同熱加工處理?xiàng)l件，對(duì)樣品（豬/雞/鴨/牛/羊）分別進(jìn)行100 ℃煮沸3 min和5 min、150 ℃燒烤7 min和10 min、180 ℃燒烤5 min和8 min，采用MRM模式對(duì)生肉和熟肉的多肽進(jìn)行確認(rèn)，鑒定了34 個(gè)多肽標(biāo)記物和20 個(gè)熱穩(wěn)定多肽。此外，Pan Xiaodong等[15]同樣通過設(shè)置不同熱加工處理?xiàng)l件對(duì)樣品（雞/綿羊/牛/豬肉）分別100 ℃加熱1、2、3.5、8 h，發(fā)現(xiàn)來源于肌球蛋白-4的肽段（KLETDISQIQGEMEDIVQEAR）是豬肉中較好的熱穩(wěn)定性多肽，采用LC-MS/MS分析方法能夠檢測(cè)出肉混合物中含有0.5%的豬肉成分。Montowska等[26]采用LESAMS方法用于鑒別不同類型的加工肉制品（蒸煮火腿，法蘭克福香腸和熱狗等）中的特異性多肽，檢測(cè)出來源于肌原纖維和肌漿蛋白的25 條熱穩(wěn)定性多肽。

1.3 物種特異性多肽的選擇原則

特異性多肽是肉及肉制品真實(shí)性鑒定的關(guān)鍵參數(shù)，通過文獻(xiàn)總結(jié)，發(fā)現(xiàn)多肽篩選遵循以下通用原則[15,23,31]：熱穩(wěn)定性強(qiáng)；獨(dú)有多肽與其他物種無同源性；質(zhì)譜易于檢測(cè)（豐度高且在低濃度時(shí)信噪比較好）；氨基酸長度為6～25 個(gè)；通常肽段中間不存在胰蛋白酶特異性的裂解位點(diǎn)；重現(xiàn)性好。

不同研究中所篩選的特異性多肽不完全一致，通過表1可以看出，大多數(shù)多肽來源于肌紅蛋白、肌球蛋白、血紅蛋白、MLC-1、3-磷酸甘油醛脫氫酶等，而肌球蛋白是特異性多肽的主要蛋白來源，這主要是由于肌肉蛋白分為肌原纖維蛋白質(zhì)（myofibrillarproteins）、肌漿蛋白質(zhì)（sarcoplasmicproteins）和基質(zhì)蛋白質(zhì)（stromaproteins）三大類，其中肌原纖維蛋白占蛋白質(zhì)總量的40%～50%，其中肌球蛋白占肌原纖維蛋白的50%～55%。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類食品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

2.1 肉類食品的源性鑒別

近年來，越來越多的文章傾向于采用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)肉類食品進(jìn)行物種真?zhèn)舞b別[47]。通過對(duì)牛、豬、馬、雞、火雞、羊等多類物種中不同蛋白來源的肽段進(jìn)行分析鑒定，篩選物種特異性多肽，從而實(shí)現(xiàn)多物種的摻假鑒別。von Bargen等[4]使用基于LC-MS/MS技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選了豬肉和馬肉的多肽標(biāo)記物，能夠檢測(cè)出牛肉中相對(duì)含量為0.5%的豬肉或馬肉，并將該方法應(yīng)用于測(cè)定深加工肉制品（如肉丸、香腸、香腸和罐裝肉）中的豬源或馬源成分。Sentandreu等[20]采用LC-MS/MS方法測(cè)定混合肉中的雞源成分，發(fā)現(xiàn)來源于MLC-3的肽段（DQGTFEDFVGLR）是雞肉的特異性多肽標(biāo)志物，可測(cè)定豬肉中相對(duì)含量為0.5%的雞肉。Stachniuk等[13]開發(fā)了一種LC-QTOF-MS/MS方法，用于檢測(cè)熱加工肉制品中的兔源成分，通過對(duì)純兔肉及含有5%～85%的兔肉與其他常見的肉類（豬肉、雞肉和羊肉）混合的肉制品進(jìn)行分析，從肌原纖維蛋白和肌漿蛋白中鑒定了49 種特異性多肽。Sentandreu等[48]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法區(qū)分熟肉中雞肉和火雞肉，在MLC-3中獲得雞肉和火雞肉的特異性多肽。雞肉和火雞肉的MLC-3具有高度的同源性，整個(gè)蛋白的氨基酸序列僅有3 個(gè)氨基酸存在差異，分別是序列的第20、47和85 位，例如火雞MLC-3蛋白在第47位含有一個(gè)蛋氨酸殘基，而雞MLC-3是異亮氨酸?；谶@些差異可獲得物種的特異性多肽，從而對(duì)熟肉中雞肉和火雞肉的成分進(jìn)行區(qū)分。

此外，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的方法已逐漸應(yīng)用于肉制品的定量分析檢測(cè)中。Prandi等[24]開發(fā)了一種在復(fù)雜的食品基質(zhì)（如肉醬）中快速檢測(cè)并定量肉制品中8 種物種（鴨肉、兔肉、雞肉、火雞肉、水牛肉、馬肉、鹿肉、羊肉）的方法，方法檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別為0.15%～0.68%和0.53%～2.30%。Sentandreu等[20]利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的多肽作為內(nèi)標(biāo)對(duì)生肉和熟肉進(jìn)行定量分析，采用LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)到雞肉多肽的含量與不同相對(duì)含量的雞肉之間存在良好的線性關(guān)系。Montowska等[49]也提出使用穩(wěn)定同位素多肽作為內(nèi)標(biāo)以監(jiān)測(cè)并定量復(fù)雜肉制品中的目標(biāo)肉類（雞/鴨/鵝/豬/牛）和致敏蛋白（大豆/牛奶/蛋清），采用同位素標(biāo)記的多肽作為內(nèi)標(biāo)，能夠減少儀器及實(shí)驗(yàn)操作過程中的不確定性，提高方法定量的準(zhǔn)確性。

2.2 肉類食品中非肉蛋白成分的鑒別

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不僅可以對(duì)肉制品中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒別，還可以測(cè)定肉制品中的非肉蛋白成分[50]。非肉蛋白來源主要包括大豆、豌豆、小麥等植物源或牛奶、血漿、蛋清等動(dòng)物源，在肉制品加工中添加外源性蛋白可以改善肉的持水力、組織結(jié)構(gòu)等功能性質(zhì)[51]，但非肉蛋白的過量添加會(huì)降低肉制品的加工成本，造成經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使的摻假行為，甚至?xí)鹨赘腥巳旱倪^敏癥狀[52]，通常引發(fā)過敏的食物基質(zhì)包括雞蛋、魚、牛奶、堅(jiān)果、花生、貝類、大豆、小麥。因此，開發(fā)出一種能夠有效鑒別非肉蛋白成分的方法具有重要意義。

表1中也列舉了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測(cè)定肉制品中非肉蛋白的方法及應(yīng)用。Li Yingying等[31]采用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)熟肉制品中豬、牛、羊、雞、鴨、大豆、花生和豌豆8 類不同物種進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果表明該方法可以很好地鑒定出肉制品中的大豆、花生和豌豆成分，實(shí)現(xiàn)了對(duì)熟肉制品中動(dòng)物源性和植物源性成分的同時(shí)鑒別。Hoffmann等[53]利用LC-MS/MS技術(shù)建立了一種同時(shí)測(cè)定肉制品中羽扇豆、豌豆和大豆的定量鑒別方法，其中羽扇豆、豌豆和大豆在肉制品中的LOD分別為2、5 mg/kg和4 mg/kg。Houston等[54]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)并比較了20 種成熟大豆品種中的10 種大豆過敏原蛋白的表達(dá)。Montowska等[55]采用液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass，LC-QTOF-MS）技術(shù)對(duì)市售肉制品中非肉類蛋白成分進(jìn)行檢測(cè)，利用該方法可以檢測(cè)到加工禽肉制品中大豆、牛奶、蛋清中致敏性蛋白的熱穩(wěn)定性多肽。

明膠是膠原蛋白部分水解而成的一種可溶性天然聚合物，目前，在豬肉、牛肉等動(dòng)物中提取的明膠被廣泛應(yīng)用于食品中，Ward等[56]建立了測(cè)定豬、牛、雞等明膠源性成分的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分別發(fā)現(xiàn)豬明膠、牛明膠和雞明膠中3、7 種和22 種多肽標(biāo)記物，該方法可用于商業(yè)明膠樣品的物種鑒定。阿膠具有抗氧化[57]、增強(qiáng)免疫力和抗衰老[58]等性能，被用作食品配料和保健品，因此，阿膠的鑒定是消費(fèi)者關(guān)注的問題之一，但對(duì)阿膠制品中驢、馬、騾子等同源物種的來源鑒定仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，迫切需要一種可靠的物種來源檢測(cè)方法。Guo Shangwei等[33]開發(fā)了一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的LC-MS/MS方法以鑒定明膠產(chǎn)品中驢、馬及騾子的來源，通過跨種比較篩選出了馬科物種的3 種特異性標(biāo)記肽（SGQPGTVGPAGVR、GASGPAGVR和GATGPAGVR），可用于鑒別阿膠制品的物種來源，當(dāng)馬、騾子的添加量分別為0.05%、0.10%時(shí)也能被檢測(cè)出來。

2.3 食品安全及可追溯性

隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)食品質(zhì)量和安全需求越來越高，而食品真實(shí)性和食品溯源技術(shù)是保障食品安全的重要手段，通過檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集、整理和分析，實(shí)現(xiàn)正向追蹤及逆行溯源，進(jìn)而建立一套食品從生產(chǎn)、加工、流通等環(huán)節(jié)的可追溯體系。蛋白質(zhì)組學(xué)所建立的高通量方法可提供食品有關(guān)的精確成分的信息，從而實(shí)現(xiàn)食品的追溯。Buckley等[34]使用固相萃取（C18ZipTip1）進(jìn)行多肽純化，利用質(zhì)譜分析獲得特異性膠原蛋白肽，通過分析來源于32 種不同哺乳動(dòng)物的膠原蛋白，共鑒定出92 條多肽可用于物種識(shí)別，但由于樣品在145 ℃、3 bar壓力下處理20 min后會(huì)丟失一些關(guān)鍵肽，因此無法區(qū)分綿羊和山羊。隨后使用MALDI-MS/MS對(duì)來自綿羊和山羊膠原蛋白的33 種氨基酸進(jìn)行了多肽測(cè)序，結(jié)果顯示這兩個(gè)物種之間存在2 條氨基酸序列的差異，該方法可以用于區(qū)分喜馬拉雅塔爾羊與羱羊等不同品種[35]。因此，質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合而構(gòu)建成溯源體系可能是未來發(fā)展的趨勢(shì)之一。

3 結(jié) 語

基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法是通過尋找物種間的差異氨基酸序列以鑒別肉類食品中的源性成分，且蛋白的一級(jí)氨基酸序列比DNA序列具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，能很好地耐受外界環(huán)境（高溫、高壓和酸堿度等）的干擾，在深加工制品的檢測(cè)分析中具有更大的優(yōu)勢(shì)。然而，當(dāng)前的蛋白質(zhì)組學(xué)方法的研究主要還是集中在食品中源性成分的定性分析或是相對(duì)含量的定量分析方面，而在絕對(duì)定量分析中的研究應(yīng)用較少，如何準(zhǔn)確測(cè)定肉制品中的含肉量是當(dāng)前肉類食品行業(yè)的難點(diǎn)之一。采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法利用質(zhì)譜技術(shù)可以對(duì)物種多肽及其來源蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量，但是由于肉中蛋白含量的不確定性，由蛋白含量推導(dǎo)出肉含量還存在一定的困難。目前，也有部分研究者開始對(duì)肉的絕對(duì)含量進(jìn)行探究，Li Yingying等[59]建立了一種內(nèi)標(biāo)法測(cè)定加工肉制品中豬肉含量的LC-MS/MS方法，篩選了碳酸酐酶3蛋白中3 條多肽作為豬的特異性定量多肽，并合成了相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)多肽，通過取不同體積的純豬肉溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而推算樣品中豬肉的準(zhǔn)確含量，該方法的回收率為80%～130%，滿足日常檢驗(yàn)的要求。該研究為當(dāng)前絕對(duì)定量分析提供了一種新的解決思路，但是該方法還存在一些不足，如用純豬肉的標(biāo)準(zhǔn)曲線去計(jì)算樣品中的豬肉含量，整個(gè)過程會(huì)受到肉制品加工工藝、水分含量、脂肪含量、不同豬肉品種等因素的影響，還需對(duì)不同影響條件進(jìn)行正交試驗(yàn)驗(yàn)證，從而得到可靠的數(shù)據(jù)結(jié)果。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究以及多技術(shù)的協(xié)同發(fā)展，物種專屬性多肽鏈將形成數(shù)據(jù)庫，方法形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，組織-蛋白-多肽之間的相互特征關(guān)系將更明確，蛋白組學(xué)的應(yīng)用將會(huì)擴(kuò)展到食品中的更多領(lǐng)域。