劉星雨，曹素芳，朱秋軼，曾志安，劉 前，李 俊，劉 果，李一峰，陳運(yùn)嬌，曹 庸,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410200）

人一生中大約有1/3的時(shí)間在睡覺[1]，熬夜與晚睡已經(jīng)成為現(xiàn)代人的標(biāo)簽，睡眠問題也成為全球最為關(guān)注的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)階段，市場(chǎng)上出現(xiàn)了越來(lái)越多的促睡眠產(chǎn)品，包括苯二氮卓、巴比妥酸鹽和唑吡坦類藥物，然而，長(zhǎng)期使用這些合成物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致一些副作用，包括失憶、共濟(jì)失調(diào)等[2-3]。為了克服這些藥物帶來(lái)的副作用，一類新的具有改善睡眠效果的天然產(chǎn)物受到了人們的廣泛關(guān)注。

牛乳源生物活性肽是指牛乳中游離的活性肽和經(jīng)過酶解后乳蛋白釋放出來(lái)的活性肽，具有多種活性（如免疫調(diào)節(jié)[4]、抗菌[5]、抗氧化、降血壓、促睡眠等[6]），目前已被廣泛應(yīng)用于各種功能性食品的研究中。有研究發(fā)現(xiàn)，牛乳源促睡眠肽具有促進(jìn)睡眠的特性，具有促進(jìn)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠效果[7]。同時(shí)，對(duì)睡眠障礙人群具有減緩相關(guān)癥狀的作用[8]，其對(duì)正常睡眠人群無(wú)副作用，且還具有鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等功能，長(zhǎng)期服用牛乳源促睡眠肽的受試者其睡眠質(zhì)量指數(shù)得分顯著提高，睡眠質(zhì)量得到提升[9]。

睡眠被認(rèn)為有兩種調(diào)控機(jī)制：一種為晝夜節(jié)律系統(tǒng)；一種為睡眠穩(wěn)態(tài)機(jī)制[10-11]。有研究人員通過減少野生型果蠅的氧化應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)野生型果蠅的睡眠質(zhì)量也有所降低，表明氧化應(yīng)激可能會(huì)通過睡眠穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)睡眠，并且驗(yàn)證了睡眠和氧化應(yīng)激之間可能存在雙向關(guān)系，即氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)睡眠，而睡眠對(duì)身體和大腦起著抗氧化劑的作用[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牛乳經(jīng)過胰蛋白酶水解后再進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀的牛乳源促睡眠肽，其活性成分主要為4 條含14～19 個(gè)氨基酸的活性肽段，相對(duì)含量為13.28%，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有較好的促睡眠效果[13]。但牛乳源促睡眠肽的促睡眠效果是否與氧化應(yīng)激有關(guān)需要進(jìn)一步研究。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基清除能力測(cè)定4 種體外抗氧化方法評(píng)價(jià)牛乳源促睡眠肽的抗氧化性，以及運(yùn)用體內(nèi)線蟲模型測(cè)定牛乳源促睡眠肽的抗氧化應(yīng)激效果。以期為牛乳源促睡眠肽的抗氧化應(yīng)激功效提供有效的理論數(shù)據(jù)，也為今后研發(fā)具有高效、無(wú)毒、天然的功能食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型秀麗隱桿線蟲（the Bristol strain N2），雌雄同體，北京市生命科學(xué)研究院惠贈(zèng)。

牛乳源促睡眠肽 廣東省綠萃生物科技有限公司；抗壞血酸、ABTS 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司公司；DPPH 西安萊恩生物科技有限公司；生化分析試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EnSpire酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；體視顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.1.1 DPPH自由基清除活性

參考陳樹俊等[14]的方法并略作改動(dòng)，用蒸餾水配制DPPH反應(yīng)溶液（0.5 mmol/L，超聲30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用），避光保存（0～4 ℃），現(xiàn)配現(xiàn)用。取96 孔板，每孔中加入50 μL 0.1 mg/mL牛乳源促睡眠肽樣品和150 μL DPPH反應(yīng)液，混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2），其中蒸餾水與DPPH反應(yīng)液混勻的吸光度為樣品對(duì)照（A0）；蒸餾水代替DPPH反應(yīng)液的吸光度為空白（A1）。以0.1 mg/mL抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品3 組平行，取平均值。DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算。

1.3.1.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

參考馬思彤等[15]的方法并略作改動(dòng)。利用蒸餾水配制7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液。將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液以體積比1∶1混勻，在避光23 ℃條件下放置12～16 h，形成ABTS陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液后置于4 ℃條件下儲(chǔ)存。使用前用蒸餾水對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專s20～25 倍），使稀釋后的溶液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02，得到ABTS陽(yáng)離子自由基工作液。在96 孔板每孔中加入100 μL 0.1 mg/mL的牛乳源促睡眠肽樣品以及100 μL ABTS陽(yáng)離子自由基工作液混勻，在30 ℃條件下反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2），其中蒸餾水與ABTS陽(yáng)離子自由基工作液混勻的吸光度為樣品對(duì)照（A0）；蒸餾水代替ABTS陽(yáng)離子自由基工作液與樣品混勻的吸光度為空白（A1）。以0.1 mg/mL抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品3 組平行組，結(jié)果取平均值。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

1.3.1.3 超氧陰離子自由基清除活性

參考李軍等[16]的方法并略作改動(dòng)。取96 孔板，每孔中加入120 μL Tris-HCI溶液（50 mmol/L、pH 8.2），25 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱25 min后加入40 μL 0.1 mg/mL牛乳源促睡眠肽樣品和20 μL鄰苯三酚溶液（25 mmol/L），在25 ℃下反應(yīng)5 min后加入20 μL鹽酸溶液（8 mol/L）以終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A2），其中蒸餾水代替樣品的吸光度為空白（A0）；蒸餾水代替鄰苯三酚溶液的吸光度為樣品對(duì)照（A1）。以0.1 mg/mL抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品3 組平行組，結(jié)果取平均值。超氧自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

1.3.1.4 羥自由基清除活性

參考丁麗麗等[17]方法并略作改動(dòng)。取96 孔板，每孔中加入20 μL 0.1 mg/mL牛乳源促睡眠肽樣品、60 μL硫酸亞鐵溶液（3 mmol/L）、60 μL過氧化氫溶液（9 mmol/L），在37 ℃下恒溫預(yù)熱10 min后加入60 μL水楊酸乙醇溶液（6 mmol/L），繼續(xù)37 ℃恒溫預(yù)熱30 min，用酶標(biāo)儀在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2），其中蒸餾水代替樣品的吸光度為空白（A0）；蒸餾水代替過氧化氫溶液與硫酸亞鐵溶液混合液的吸光度為樣品對(duì)照（A1）。以0.1 mg/mL抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品3 組平行組，結(jié)果取平均值。羥自由基清除率按公式（4）計(jì)算。

1.3.2 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)和同期化處理

秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)使用線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），在表面涂布有OP50大腸桿菌作為線蟲的食物，于20 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本文實(shí)驗(yàn)所用線蟲均為經(jīng)過同期化處理生長(zhǎng)至L4期的線蟲，體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)牛乳源促睡眠肽的應(yīng)用質(zhì)量濃度為1 mg/mL。根據(jù)Lin Chunxiu等[18]的方法，采用高氯酸鈉裂解法對(duì)線蟲進(jìn)行同期化處理。

1.3.2.2 秀麗隱桿線蟲給藥

實(shí)驗(yàn)操作參考王晉等[19]的方法并略作改動(dòng)，配制1 mg/mL牛乳源促睡眠肽溶液，過濾除菌后，與大腸桿菌OP50菌液以質(zhì)量比1∶9混合均勻，樣品組吸取100 μL牛乳源促睡眠肽溶液與大腸桿菌OP50菌液混合溶液于NGM平板上喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，空白組吸取100 μL大腸桿菌OP50菌液于NGM平板上喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲。此條件下，藥物通過秀麗隱桿線蟲攝食而進(jìn)入到秀麗隱桿線蟲體內(nèi)，并根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求喂養(yǎng)至不同時(shí)期再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.3.2.3 正常壽命測(cè)定

壽命的測(cè)定是為了判斷牛乳源促睡眠肽在抗氧化的同時(shí)，是否會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)操作參考王晉等[19]的方法并略作改動(dòng)，將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲挑至涂有樣品（或者空白組）的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待秀麗隱桿線蟲孵化生長(zhǎng)至L4期后，將秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM板中，此后每隔1 d轉(zhuǎn)移一次，以排除它們后代的影響。秀麗隱桿線蟲死亡的數(shù)量根據(jù)它們是否對(duì)刺激有反應(yīng)來(lái)確定。在統(tǒng)計(jì)分析中，不計(jì)算培養(yǎng)基內(nèi)孵化或逃離培養(yǎng)基的秀麗隱桿線蟲。秀麗隱桿線蟲平均壽命計(jì)算見公式（5）。中位壽命是指存活率等于50%的培養(yǎng)時(shí)間；最長(zhǎng)壽命是指存活率等于0的培養(yǎng)時(shí)間。

式中：j是秀麗隱桿線蟲壽命/d；dj是死于年齡區(qū)間（xj，xj＋1）秀麗隱桿線蟲的數(shù)量；n是秀麗隱桿線蟲的總數(shù)。

1.3.2.4 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激壽命測(cè)定

H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)操作參考Lin Chunxiu等[20]的方法并略作改動(dòng)，挑取60 只已給藥3 d的秀麗隱桿線蟲暴露于稀釋了1 000 倍的體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激壓力下。每隔30 min觀察并記錄各組秀麗隱桿線蟲的死亡情況，直至所有秀麗隱桿線蟲死亡，秀麗隱桿線蟲死亡判定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.2.3節(jié)。

1.3.2.5 熱應(yīng)激下的壽命測(cè)定

熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)操作參考Li Wei等[21]的方法并略作改動(dòng)，將L4期的秀麗隱桿線蟲從20 ℃的培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 h觀察并記錄各組秀麗隱桿線蟲的死亡情況，直至所有秀麗隱桿線蟲死亡，秀麗隱桿線蟲死亡判定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.2.3節(jié)。

1.3.2.6 生殖能力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)操作參考王鳳等[22]的方法并略作改動(dòng)，將同期化后L4期的秀麗隱桿線蟲每組挑取2 條秀麗隱桿線蟲單獨(dú)飼養(yǎng)，此時(shí)記為第1天。然后，每24 h將秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)至新NGM培養(yǎng)基，直至生殖能力喪失（培養(yǎng)基上不產(chǎn)生新的蟲卵）。20 ℃下孵育產(chǎn)卵板（帶有線蟲卵的NGM培養(yǎng)基），48 h后計(jì)數(shù)子代數(shù)目，即產(chǎn)卵量，以此評(píng)價(jià)秀麗隱桿線蟲的生殖能力。

1.3.2.7 頭部擺動(dòng)次數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)操作參考王晉等[19]的方法并略作改動(dòng)，將L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到樣品組和空白對(duì)照組秀麗隱桿線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在第4、8天和第12天時(shí)觀察秀麗隱桿線蟲在30 s內(nèi)的頭部擺動(dòng)次數(shù)，以此評(píng)價(jià)秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)能力。

1.3.2.8 移動(dòng)能力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)操作參考王晉等[19]的方法并略作改動(dòng)，在壽命實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行移動(dòng)能力測(cè)定，在第3、7、11天觀察并記錄秀麗隱桿線蟲的移動(dòng)能力。記錄標(biāo)準(zhǔn)：1）秀麗隱桿線蟲自發(fā)運(yùn)動(dòng)，不需要觸碰刺激，記為A；2）秀麗隱桿線蟲必須受到觸碰刺激才運(yùn)動(dòng)，記為B；3）秀麗隱桿線蟲受到觸碰刺激后只擺動(dòng)頭或尾，記為C。記錄各移動(dòng)能力秀麗隱桿線蟲所占的比例。

1.3.2.9 體內(nèi)抗氧化效果指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)Lin Chunxiu等[23]的方法，將同期化并升溫處理后的秀麗隱桿線蟲沖洗并收集至EP管中，用裂解液重懸冰上勻漿，然后。按照試劑盒的說明書對(duì)秀麗隱桿線蟲勻漿液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過SPSS 19.0軟件對(duì)兩組間的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異。其中，生存曲線使用GraphPad（Windows 5.00版）軟件進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳源促睡眠肽對(duì)4 種體外抗氧化活性指標(biāo)的影響

由表1可知，牛乳源促睡眠肽具有較強(qiáng)的DPPH自由基（44.27%）和ABTS陽(yáng)離子自由基（24.83%）清除能力，相同質(zhì)量濃度下，效果均與陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸無(wú)顯著差異（P＞0.05）。牛乳源促睡眠肽也具有一定的羥自由基（18.37%）和超氧陰離子自由基（37.22%）清除能力，相同質(zhì)量濃度下，效果分別為陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸的70.46%和78.11%。因此，牛乳源促睡眠肽具有較好的體外抗氧化能力，下面進(jìn)一步探究其是否具有體內(nèi)抗氧化以及延緩衰老的能力。

表1 牛乳源促睡眠肽的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of milk-derived sleep-promoting peptide

2.2 牛乳源促睡眠肽對(duì)秀麗隱桿線蟲氧化衰老的影響

2.2.1 對(duì)體內(nèi)抗氧化酶活力及MDA含量的影響

抗氧化防御系統(tǒng)為機(jī)體發(fā)揮抗氧化性重要的組成部分[24]。由圖1A～C可知，與空白組相比，樣品組的SOD、CAT、GSH-Px活力分別提高了52.3%、32.7%、60.7%（P＜0.05、P＜0.01）。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的一種天然產(chǎn)物，其含量被廣泛應(yīng)用于反映脂質(zhì)氧化程度[22]。由圖1D可知，樣品組具有更低的MDA含量，樣品組比空白組極顯著降低了46.9%（P＜0.01）。以上數(shù)據(jù)表明，牛乳源促睡眠肽可能在一定程度上提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化能力，延緩秀麗隱桿線蟲的氧化損傷和衰老，具有激活秀麗隱桿線蟲抗氧化防御系統(tǒng)的潛力。

圖1 牛乳源促睡眠肽對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD（A）、CAT（B）、GSH-Px（C）活力和MDA含量（D）的影響Fig. 1 Effect of milk-derived sleep-promoting peptide on activities of SOD (A), CAT (B), GSH-Px (C) and MDA content (D) in C. elegans

2.2.2 對(duì)正常壽命的影響

由圖2可知，與空白組相比，樣品組秀麗隱桿線蟲生存曲線明顯右移。由表2可知，與空白組相比，樣品組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、中位壽命和最長(zhǎng)壽命都得到極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）。說明牛乳源促睡眠肽能明顯延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命。

圖2 正常條件下秀麗隱桿線蟲的生存曲線Fig. 2 Survival curves of C. elegans under normal conditions

表2 秀麗隱桿線蟲存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of survival time of C. elegans

2.2.3 對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激性的影響

如圖3所示，在H2O2急性氧化脅迫下，牛乳源促睡眠肽促使線蟲生存曲線向右移。由表2可知，與空白組相比，樣品組秀麗隱桿線蟲的平均壽命得到極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），最長(zhǎng)壽命得到顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。說明牛乳源促睡眠肽具有提高線蟲的抗氧化應(yīng)激的潛力。

圖3 H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫下秀麗隱桿線蟲的生存曲線Fig. 3 Survival curve of C. elegans under H2O2-induced oxidative stress

2.2.4 對(duì)秀麗隱桿線蟲抗熱應(yīng)激的影響

如圖4所示，在37 ℃急性熱應(yīng)激環(huán)境下，牛乳源促睡眠肽促使秀麗隱桿線蟲生存曲線明顯右移。由表2可知，與空白組相比，樣品組秀麗隱桿線蟲的平均壽命和中位壽命都得到極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），最長(zhǎng)壽命延長(zhǎng)了5.62%。說明牛乳源促睡眠肽具有提高秀麗隱桿線蟲抗熱應(yīng)激的潛力。

圖4 熱應(yīng)激脅迫下秀麗隱桿線蟲的生存曲線Fig. 4 Survival curve of C. elegans under heat shock stress

2.2.5 對(duì)生殖能力的影響

有研究表明，秀麗隱桿線蟲的壽命與生殖能力之間存在“利弊權(quán)衡（trade off）”，即延長(zhǎng)壽命將以降低或喪失生殖能力為代價(jià)[25]。如圖5所示，與空白組相比，樣品組的產(chǎn)卵量雖然在第2天時(shí)有所降低，但秀麗隱桿線蟲的總產(chǎn)卵量并無(wú)顯著差異，因此認(rèn)為牛乳源促睡眠肽不會(huì)損害秀麗隱桿線蟲的生殖能力。

圖5 牛乳源促睡眠肽對(duì)秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響Fig. 5 Effect of milk-derived sleep-promoting peptide on the fertility of C. elegans

2.2.6 對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的影響

如圖6所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)次數(shù)逐漸減少，說明在秀麗隱桿線蟲的衰老過程中，其運(yùn)動(dòng)行為能力逐漸下降。與空白組相比，樣品組秀麗隱桿線蟲在第4天和第8天的頭部擺動(dòng)次數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05），但樣品組秀麗隱桿線蟲在第12天的頭部擺動(dòng)次數(shù)顯著提高（P＜0.05）。對(duì)比空白組，樣品組秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)次數(shù)在培養(yǎng)前8 d沒有顯著降低，在第12天時(shí)顯著增加，說明牛乳源促睡眠肽在延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲壽命和對(duì)生殖能力沒有顯著影響的前提下，沒有對(duì)秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力造成不利影響，反而在生命后期對(duì)運(yùn)動(dòng)能力有促進(jìn)作用。

圖6 牛乳源促睡眠肽對(duì)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)次數(shù)的影響Fig. 6 Effect of milk-derived sleep-promoting peptide on head swinging frequency of C. elegans

2.2.7 對(duì)移動(dòng)能力的影響

有研究表明，秀麗隱桿線蟲的衰老伴隨著移動(dòng)能力及對(duì)外界機(jī)械刺激反應(yīng)的退化[26]。如圖7所示，牛乳源促睡眠肽能明顯提高秀麗隱桿線蟲移動(dòng)能力，在生命后期（第11天）尤其顯著。說明促睡眠肽具有提高秀麗隱桿線蟲抗衰老的潛力。

圖7 牛乳源促睡眠肽對(duì)秀麗隱桿線蟲移動(dòng)能力的影響Fig. 7 Effect of milk-derived sleep-promoting peptide on the locomotivity of C. elegans

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用了DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定4 種體外自由基清除方法評(píng)價(jià)牛乳源促睡眠肽的抗氧化活力，結(jié)果表明，牛乳源促睡眠肽在體外能有效清除自由基，具有良好的抗氧化活性，其中DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異，清除率分別為49.77%和29.37%，說明牛乳源促睡眠肽的體外抗氧化性可能與其DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力密切相關(guān)；對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基也有較好的清除效果，清除率分別為26.07%和47.65%。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲衰老的關(guān)鍵因素，秀麗隱桿線蟲的抗氧化應(yīng)激能力和壽命有較好的相關(guān)性[27]，壽命會(huì)隨著抗氧化應(yīng)激能力的提高而提高[28]。本次實(shí)驗(yàn)中牛乳源促睡眠肽處理后的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px 3 種抗氧化酶活力顯著提高，MDA含量顯著降低，并且其在正常、H2O2和熱應(yīng)激氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲的存活率顯著增加，移動(dòng)能力和頭部擺動(dòng)次數(shù)與空白組相比沒有顯著降低。說明牛乳源促睡眠肽在對(duì)秀麗隱桿線蟲移動(dòng)能力沒有負(fù)面影響的同時(shí)能有效延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命，增強(qiáng)其對(duì)外界壓力的抗逆性。

此前有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與睡眠存在著雙向關(guān)系[12]。近期也有研究報(bào)道，長(zhǎng)期不睡覺可能會(huì)因?yàn)槟c道中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量積累導(dǎo)致猝死[29]。過量ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物分子功能損傷[30]。中和ROS可以使果蠅在很少或沒有睡眠的情況下正常存活，說明促睡眠物質(zhì)的促睡眠作用可能與抗氧化活性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)綜合體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛乳源促睡眠肽能有效清除自由基和提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力。

本研究初步表明牛乳促睡眠肽可作為天然的食品抗氧化劑加以開發(fā)利用，為以后牛乳源促睡眠肽在功能食品方面的進(jìn)一步研究提供理論和實(shí)驗(yàn)參考，但是其產(chǎn)生抗氧化作用的具體作用機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步的研究。