馬洪波，董燕嬌，孫琨，王碩，王洪云

（淄博市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 淄博255036）

狼瘡腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見的并發(fā)癥，臨床主要表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、腎功能不全等，是由腎內(nèi)自身抗體與抗原結(jié)合形成的免疫復(fù)合物沉積在腎小球等不同部位造成的免疫損傷所致。現(xiàn)階段狼瘡腎炎的病因尚未完全明確，也缺乏根治性的治療措施，新的靶向治療或免疫抑制劑的開發(fā)為狼瘡腎炎的治療提供了更多選擇[1-3]。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）指的是長度＞200 個核苷酸、缺乏蛋白編碼能力的RNA，分子內(nèi)部二級空間結(jié)構(gòu)特定且復(fù)雜，有多個位點(diǎn)可與蛋白質(zhì)結(jié)合，還能夠通過堿基互補(bǔ)配對的原則與DNA、RNA 發(fā)生特異性的相互作用，使其適當(dāng)?shù)氖Щ罨蚣せ睿瑓⑴c各類生物學(xué)進(jìn)程[4]。競爭內(nèi)源性RNA（ceRNA）可以通過競爭性地結(jié)合microRNA 來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，lncRNA就是作為ceRNA 競爭性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)大量microRNA，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游基因并參與到多種生物學(xué)行為中。

lncRNA 牛磺酸上調(diào)基因1（taurine upregulated gene 1, TUG1）位于染色體22q12，被證明與癌癥有關(guān)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，TUG1 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中表達(dá)降低[9]。MicroRNA-144（miR-144）與血紅素和自身限制性炎癥有關(guān)，血紅素通過上調(diào)miR-144-3p的表達(dá)延緩自身限制性炎癥的消退[10]。此外，一項(xiàng)關(guān)于IgA 腎病的研究[11]發(fā)現(xiàn)，來源于尿紅細(xì)胞的miR-144-3p 在IgA 腎病患者尿沉渣中表達(dá)升高，其可作為IgA 腎病的診斷標(biāo)志物。但目前尚未明確miR-144 與狼瘡腎炎的進(jìn)展是否有關(guān)。本研究從ceRNA 理論角度出發(fā)，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測lncRNA TUG1 的下游靶點(diǎn)，并通過動物實(shí)驗(yàn)探討其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及在狼瘡腎炎中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑與儀器

10 周齡雄性B6.MRL-FaslprNju 系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠20 只，體重（26.5±1.5）g；10 周齡C57BL/6健康雄性小鼠5 只，體重（26.5±1.6）g；均購自南京大學(xué)模式動物研究所[動物實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK（蘇）2019-0056]?；A(chǔ)培養(yǎng)液、Annexin-V-FITC/PI 雙標(biāo)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Trizol試劑盒、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、裂解液均購自武漢默沙克生物科技有限公司， Ambion PARISTM試劑盒（AM1921）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，HEK-293T 細(xì) 胞、 TUG1-3'-UTR-WT 和TUG1-3'-UTR-MUT 質(zhì)粒購自湖南豐暉生物科技有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自上海漢恒生物科技有限公司，兔抗Ⅳ型膠原（Collagen Ⅳ, Col Ⅳ）抗體、纖連蛋白（Fibronectin, FN）抗體和GAPDH 抗體購自北京義翹神州科技有限公司，TBST 緩沖液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，噻唑藍(lán)（MTT）購自廣州銳博生物科技有限公司，Transwell 試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，酶聯(lián)免疫檢測儀、共聚焦顯微鏡均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，倒置顯微鏡（Axio Vert.A1）購自德國卡爾蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 B6.MRL-FaslprNju 系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠和C57BL/6 小鼠在適應(yīng)性條件下喂養(yǎng)5 d。每天收集B6.MRL-FaslprNju 系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠24 h 尿量，試紙測定尿蛋白濃度＞1 mg/L表明狼瘡腎炎發(fā)病，為狼瘡腎炎組（n=20）。C57BL/6 小鼠為正常組（n=5）。

1.2.2 腎小球系膜細(xì)胞分離純化 將正常組和狼瘡腎炎組小鼠麻醉后快速斷頸處死，每只小鼠取1 g腎臟組織保存?zhèn)溆?，同時分離腎小球系膜細(xì)胞并純化。細(xì)胞分離純化步驟：生理鹽水清洗腎組織，然后將腎皮質(zhì)剪碎，依次放入400 目、200 目、100 目共3 種不同孔徑的篩網(wǎng)中輕輕碾壓并用生理鹽水沖洗，在最底層的篩網(wǎng)吸出一部分組織鏡下觀察，在組織中加入膠原酶消化30 min，當(dāng)有完整的細(xì)胞散出時加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基使消化終止。將沉淀物分散均勻然后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 小時換新培養(yǎng)液，5 d 左右細(xì)胞傳1 代，4～6 代細(xì)胞為純化后的腎小球系膜細(xì)胞。

1.2.3 qRT-PCR 檢測正常組和狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUG1 和miR-144 mRNA的相對表達(dá)量 Trizol 試劑盒提取正常組和狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞的總RNA，紫外線吸收法檢測RNA 純度和濃度。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為樣品cDNA。依據(jù)qRT-PCR 試劑盒說明書擴(kuò)增cDNA，將PCR 管置于DNA 擴(kuò)增儀，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 次循環(huán)，之后72℃延伸10 min。lncRNA TUG1 內(nèi)參為GAPDH，miR-144 內(nèi)參為U6。引物的設(shè)計(jì)和合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成，引物序列見表1。采用2－ΔΔCt法計(jì)算lncRNA TUG1 和miR-144 mRNA 的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.4 lncRNA TUG1 亞細(xì)胞定位和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用PSORT 亞細(xì)胞定位網(wǎng)站（https://www.genscript.com/psort.html）預(yù)測TUG1 在細(xì)胞中表達(dá)的位置。采用Ambion PARISTM（AM1921）試劑盒分離狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作；采用qRT-PCR 檢測細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中l(wèi)ncRNA TUG1 mRNA 相對表達(dá)量，具體過程同1.2.3。通過RNA22 網(wǎng)站（https://cm.jefferson.edu/rna22/）預(yù)測lncRNA TUG1 和miR-144 的結(jié)合位點(diǎn)，之后通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測兩者的關(guān)系。狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：分離腎小球系膜細(xì)胞，將其置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染并分為NC 組（腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照序列）、TUG1 過表達(dá)組（腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1）、sh-TUG1 組（腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-TUG1）、miR-144 mimic 組（腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-144 mimic）、TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組（腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1 和miR-144 mimic）。

1.2.5 ELISA 法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子的表達(dá) NC 組、TUG1 過表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic 組、TUG1過表達(dá)+miR-144 mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，采用ELISA 法檢測培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm 波長處的吸光度值。

1.2.6 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞Col Ⅳ、FN蛋白相對表達(dá)量 收集NC 組、TUG1 過表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic 組、TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組轉(zhuǎn)染后的腎小球系膜細(xì)胞，加入裂解液冰上裂解30 min，3 000 r/min 離心10 min，收取上清液，行SDS-PAGE 電泳，加熱使蛋白變性。轉(zhuǎn)膜加入兔抗Col Ⅳ、FN 和GAPDH 抗體，常溫?fù)u床封閉過夜孵育后TBST 洗膜，再加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG。以GAPDH 抗體為內(nèi)參。常溫?fù)u床孵育2 h，收集顯色發(fā)光圖像，采用Image J 軟件計(jì)算Col Ⅳ、FN 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞相對增殖活力 配置NC 組、TUG1 過表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic 組、TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組單個細(xì)胞懸液，以每孔2×105個細(xì)胞接種到96 孔板，將培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h取出培養(yǎng)板，每孔加入15 μL MTT 溶液，繼續(xù)在37℃環(huán)境中培養(yǎng)4 h。停止培養(yǎng)后，2 000 r/min 離心5 min，抽吸棄孔內(nèi)上清液。每個孔內(nèi)加150 μL 二甲基亞砜（DMSO），震蕩孵育10 min。最后使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm 波長處的吸光度值。

1.2.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞侵襲數(shù)將Transwell 小室置于24 孔板，PBS 沖洗，胰酶消化后收集NC 組、TUG1 過表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic 組、TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組細(xì)胞，3 000 r/min 離心10 min。重懸細(xì)胞后取200 μL 細(xì)胞懸液，鋪板并培養(yǎng)。24 孔板下室加入500 μL 含趨化因子的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后采用5%結(jié)晶紫染液染色2 min，采用光學(xué)顯微鏡觀察染色情況，拍照后采用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 采用Annexin-V-FITC/PI 雙標(biāo)染色試劑盒，轉(zhuǎn)染后懸浮生長的細(xì)胞中加Annexin-V-FITC 結(jié)合液，避光孵育15 min 后低溫2 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，再加入Annexin-V-FITC 結(jié)合液和配置好的PI染色液，暗室冰浴5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測NC組、TUG1 過表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic組、TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組細(xì)胞凋亡情況。液體配置和步驟按試劑盒說明書操作。細(xì)胞凋亡率=細(xì)胞早期凋亡率+細(xì)胞晚期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)（上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功分離純化腎小球系膜細(xì)胞

使用倒置顯微鏡觀察腎小球系膜細(xì)胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的體積大，形態(tài)為成纖維細(xì)胞狀，胞體多為不規(guī)則的梭形、多角形；胞質(zhì)具有多個突起，向四周延伸；胞核則位于細(xì)胞的中央，呈卵圓形或圓形。見圖1。

圖1 腎小球系膜細(xì)胞 （倒置顯微鏡×400）

2.2 狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá)被抑制而miR-144表達(dá)增強(qiáng)

正常組小鼠腎小球系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUG1 mRNA 相對表達(dá)量為（1.00±0.09），miR-144 mRNA相對表達(dá)量為（1.00±0.07）；狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞lncRNA TUG1 mRNA 相對表達(dá)量為（0.56±0.04），miR-144 mRNA 相對表達(dá)量為（1.62±0.20）。正常組和狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞lncRNA TUG1 和miR-144 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.526 和4.896，P=0.011 和0.008），狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞lncRNA TUG1 mRNA相對表達(dá)量降低，miR-144 mRNA 相對表達(dá)量升高。見圖2。

圖2 正常組和狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞lncRNA TUG1和miR-144 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

2.3 lncRNA TUG1能夠作為ceRNA吸附miR-144

通過亞細(xì)胞定位網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA TUG1 mRNA 相對表達(dá)量為（1.42±0.13），細(xì)胞核為（1.00±0.09），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.601，P=0.010），細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA TUG1 mRNA 相對表達(dá)量較高。通過RNA22 網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1 和miR-144 存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，兩者有靶向關(guān)系：TUG1-3'-UTR-WT 中，與NC 組（1.00±0.11）比較，miR-144 mimic 組（0.52±0.03）的HEK-293T 細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（t=7.292，P=0.002）；在TUG1-3'-UTR-MUT 中，NC 組與miR-144 mimic 組的HEK-293T 細(xì)胞熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 lncRNA TUG1和miR-144的靶向關(guān)系

2.4 lncRNA TUG1抑制狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子的分泌且能被miR-144阻斷

NC 組、TUG1 過表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic組、TUG1過表達(dá)+miR-144 mimic組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，結(jié)果：與NC 組比較，TUG1過 表達(dá)組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 降低（q=4.087、4.380 和5.583，均P=0.000），sh-TUG1 組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（q=4.065、9.432 和3.970，均P=0.000），miR-144 mimic 組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（q=8.066、5.933 和8.840，均P=0.000）；TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平與NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.670、0.276 和0.310，均P＞0.05）。見表2。

表2 各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 （pg/mL，±s）

表2 各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 （pg/mL，±s）

組別NC組TUG1過表達(dá)組sh-TUG1組miR-144 mimic組TUG1過表達(dá)+miR-144 mimic組F 值P 值TNF-α 56.31±4.87 37.45±4.05 75.18±5.64 93.65±7.87 53.22±5.41 43.241 0.000 IL-1β 159.01±10.11 125.77±9.47 230.77±9.21 204.15±8.91 161.15±8.94 58.694 0.000 IL-6 85.61±6.54 49.05±4.25 110.62±8.64 142.05±10.28 83.41±8.62 56.927 0.000

2.5 lncRNA TUG1抑制狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞Col Ⅳ、FN蛋白的表達(dá)且能被miR-144阻斷

NC 組、TUG1 過 表達(dá)組、sh-TUG1 組、miR-144 mimic 組、TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組的Col Ⅳ、FN 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，結(jié)果：與NC 組比較，TUG1 過表達(dá)組的Col Ⅳ、FN 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），sh-TUG1 組和miR-144 mimic 組Col Ⅳ、FN 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組Col Ⅳ、FN 蛋白相對表達(dá)量與NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖4。

圖4 各組腎小球系膜細(xì)胞Col Ⅳ與FN蛋白的表達(dá)

表3 各組Col Ⅳ與FN蛋白相對表達(dá)量的比較 （±s）

表3 各組Col Ⅳ與FN蛋白相對表達(dá)量的比較 （±s）

?

2.6 lncRNA TUG1 抑制狼瘡腎炎組小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡且能被miR-144 阻斷

各組不同時間點(diǎn)的腎小球系膜細(xì)胞增殖活力比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)的腎小球系膜細(xì)胞增殖活力有差異（F=1 389.000，P=0.000）；②各組腎小球系膜細(xì)胞增殖活力有差異（F=148.300，P=0.000）；③各組的細(xì)胞增殖活力變化趨勢有差異（F=12.430，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，與NC 組48 h 和72 h 比較，TUG1 過表達(dá)組48 h 和72 h 細(xì)胞增殖活力降低（q=4.687 和7.169，均P=0.000），sh-TUG1 組48 h 和72 h 細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)（q=4.685 和8.823，均P=0.000），miR-144 mimic 組48 h 和72 h 細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)（q=7.444 和12.130，均P= 0.000）（見表4）。各組腎小球系膜細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，結(jié)果：與NC 組比較，TUG1 過表達(dá)組的細(xì)胞侵襲數(shù)減少（q=2.828，P=0.047），細(xì)胞凋亡率升高（q=13.450，P=0.000）；sh-TUG1 組細(xì)胞侵襲數(shù)增多（q=4.108，P=0.000），細(xì)胞凋亡率降低（q=2.781，P=0.000）；miR-144 mimic 組細(xì)胞侵襲數(shù)增多（q=4.768，P=0.000）、細(xì)胞凋亡率降低（q=3.252，P=0.006）；TUG1 過表達(dá)+miR-144 mimic 組的細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞凋亡率與NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.355 和1.318，P=0.682 和0.189）。見 表5 和圖5、6。

圖5 各組腎小球系膜細(xì)胞侵襲結(jié)果 （共聚焦顯微鏡×400）

表4 各組不同時間點(diǎn)的腎小球系膜細(xì)胞增殖活力比較（±s）

表4 各組不同時間點(diǎn)的腎小球系膜細(xì)胞增殖活力比較（±s）

組別NC組TUG1過表達(dá)組sh-TUG1組miR-144 mimic組TUG1過表達(dá)+miR-144 mimic組24 h 0.43±0.03 0.36±0.02 0.53±0.04 0.62±0.05 0.46±0.03 48 h 0.72±0.04 0.55±0.02 0.89±0.05 0.99±0.06 0.77±0.04 72 h 1.21±0.04 0.95±0.02 1.53±0.07 1.65±0.07 1.28±0.05

表5 各組腎小球系膜細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

表5 各組腎小球系膜細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

組別NC組TUG1過表達(dá)組sh-TUG1組miR-144 mimic組TUG1過表達(dá)+miR-144 mimic組F 值P 值細(xì)胞侵襲數(shù)/個204.23±19.14 162.35±17.08 285.11±29.32 298.15±32.07 211.33±20.26 16.803 0.000細(xì)胞凋亡率/%11.25±0.91 26.53±2.44 8.21±0.96 7.53±0.82 12.71±1.32 88.492 0.000

圖6 各組細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

腎損傷并發(fā)癥仍被認(rèn)為是繼感染位居第二的死亡原因，大約40%～70%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者都會并發(fā)狼瘡腎炎，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者重要的死亡因素[12]。狼瘡腎炎主要病變特點(diǎn)為腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖，系膜細(xì)胞的過度增殖可以釋放大量的炎癥因子，加劇炎癥和引起腎小球硬化[13]。

lncRNA 與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有著密切聯(lián)系[14]。TUG1 作為lncRNA 的一員，GU 等[15]的研究證實(shí)在慢性阻塞性肺疾病中上調(diào)TUG1可以調(diào)控細(xì)胞炎癥分子分泌；同樣CAO 等[16]證明在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織中TUG1 表達(dá)降低；XU 等[17]也發(fā)現(xiàn)，在狼瘡腎炎中，TUG1 在抑制細(xì)胞損傷和誘發(fā)炎癥等方面起重要的調(diào)節(jié)作用。因此本研究關(guān)注TUG1 在狼瘡腎炎中的作用和具體調(diào)控機(jī)制并探究其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MicroRNA 是一種編碼長度約22 nt 的RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在許多生理和病理過程中，都發(fā)揮著重要的作用[18]。miR-144 以往被發(fā)現(xiàn)在IgA 腎病中表達(dá)增強(qiáng)并且可以在IgA 腎病的分子診斷中發(fā)揮作用[11]。而本研究進(jìn)一步證實(shí)了miR-144 在狼瘡腎炎組小鼠腎組織中表達(dá)升高，表明miR-144 與狼瘡腎炎發(fā)病有很大關(guān)系。

腎小球系膜細(xì)胞是腎臟的主要功能細(xì)胞，腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子大量分泌是狼瘡腎炎的重要病變表現(xiàn)，狼瘡腎炎發(fā)病時，TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子分泌增強(qiáng)，進(jìn)一步使腎組織其他細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球纖維化，而腎小球纖維化是腎臟由健康到損傷、最后到功能喪失的早期標(biāo)志[19]。本研究通過ELISA 法檢測各組腎小球系膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平，發(fā)現(xiàn)TUG1 過表達(dá)或抑制miR-144 表達(dá)都會使TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平降低。FN 為一種高分子血漿糖蛋白，在腎臟中的主要功能是通過結(jié)合纖維蛋白、纖維蛋白原及膠原，使其他膠原沉積在腎小管和間質(zhì)。FN在腎損傷早期顯著增加，隨著疾病發(fā)展，后期呈現(xiàn)顯著升高趨勢，加劇腎臟纖維化病變，是腎臟纖維化病變的主要標(biāo)志物之一[20]。Col Ⅳ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，構(gòu)成基膜并調(diào)控細(xì)胞黏附，可以作為檢測臟器纖維化的標(biāo)志蛋白[21]。本研究發(fā)現(xiàn)纖維化因子標(biāo)志蛋白FN 與Col Ⅳ的表達(dá)可以被TUG1 抑制且能被miR-144 逆轉(zhuǎn)。在健康狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞更新很緩慢，但在病理狀態(tài)下，系膜細(xì)胞增殖活躍，功能亢進(jìn)，系膜細(xì)胞凋亡減少，過度增殖會導(dǎo)致腎小球纖維化，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化，影響腎臟功能[22-24]，本研究通過MTT、Transwell 法及流式細(xì)胞術(shù)對各組腎小球系膜細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)TUG1 過表達(dá)能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡。

綜上所述，相對于正常健康小鼠，狼瘡腎炎小鼠腎小球系膜細(xì)胞中TUG1 表達(dá)低，miR-144 表達(dá)高，TUG1 能夠靶向調(diào)控miR-144 進(jìn)而抑制腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子水平及細(xì)胞增殖活性。TUG1和miR-144 為狼瘡腎炎的治療提供了新的靶點(diǎn)和依據(jù)，但需進(jìn)一步研究證實(shí)更多的機(jī)制。