尹倩倩，李今朝

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 錦州121011）

急性ST 段抬高型心肌梗死（acute ST-elevation myocardial infarction, STEMI）是冠心病的嚴(yán)重類型，為致死致殘的主要原因，其發(fā)病突然，進(jìn)程兇險(xiǎn)，轉(zhuǎn)歸難以預(yù)測(cè)，且發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）是目前臨床治療STEMI 的首選方法之一[3]。但由于院前及院內(nèi)等延誤導(dǎo)致部分STEMI 患者再灌注不及時(shí)，術(shù)后仍有心律失常、心功能不全等心血管不良事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，影響患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。生物體受到內(nèi)、外界刺激后，體內(nèi)的代謝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化，代謝組學(xué)就是通過分析內(nèi)源性代謝物的變化來反映機(jī)體的狀態(tài)。本研究旨在利用靶向代謝組學(xué)方法研究行PCI 治療的STEMI 患者的血液代謝譜，篩選差異代謝物，探究與STEMI預(yù)后可能相關(guān)的標(biāo)志物，為及早開通閉塞冠狀動(dòng)脈（以下簡(jiǎn)稱冠脈）帶來的獲益提供代謝組學(xué)方面的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年3月－2019年9月經(jīng)急診就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為STEMI，并行PCI治療的患者43 例。STEMI 患者入選標(biāo)準(zhǔn)參照2019 版《急性ST 段抬高性心肌梗死診斷和治療指南》[4]，排除標(biāo)準(zhǔn)：①有陳舊性心肌梗死病史，曾行冠脈搭橋術(shù)、溶栓治療行補(bǔ)救性PCI 者；②風(fēng)濕熱、先天性心臟疾病、心肌炎、心肌病等其他心臟疾病者；③合并嚴(yán)重全身感染、腦血管疾病、風(fēng)濕病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、骨關(guān)節(jié)病及肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，所有入選患者均自愿參與且簽署知情同意書。

1.2 方法

《急性ST 段抬高性心肌梗死診斷和治療指南》[4]提出120 min 內(nèi)能完成PCI 治療的首選PCI，否則應(yīng)在首次醫(yī)療接觸（first medical contact,FMC）30 min 內(nèi)開始溶栓。本研究將＜120 min 完成PCI 的定義為A 組（20 例），＞120 min 未溶栓行PCI 治療的定義為B 組（23 例）。記錄兩組患者院內(nèi)及隨訪期間心血管不良事件發(fā)生情況與心臟彩超左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）。分別于PCI術(shù)前、術(shù)后第2天、術(shù)后1 個(gè)月采指尖血，滴于專用采血濾紙上晾干后送檢。

參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行樣本預(yù)處理。將氨基酸內(nèi)標(biāo)和肉堿內(nèi)標(biāo)分別加入1 mL 純甲醇，將這些同位素標(biāo)準(zhǔn)品混合在一起儲(chǔ)存在4℃冰箱中，使用時(shí)再將其稀釋100 倍作為工作溶液。每100 μL 工作溶液被分配到一個(gè)含有干血點(diǎn)樣本（DBS）圓盤的孔中。在室溫下輕輕搖動(dòng)平板20 min，3 000 r/min 離心2 min，將濾液收集到新的96 孔平板中，每個(gè)平板中加入質(zhì)量控制（QC）樣本監(jiān)測(cè)代謝組學(xué)分析測(cè)得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。濾液和QC 溶液在50℃下用純氮?dú)飧稍?。每個(gè)干燥樣品在60 μL 1-丁醇和乙酰氯的混合物（90∶10）中，65℃下衍生20 min。50℃下再次用純氮?dú)飧稍镅苌芤骸Ｔ诖x組學(xué)分析之前，將100 μL 流動(dòng)相溶液加入到每個(gè)孔中。

最后進(jìn)行代謝組學(xué)分析。在裝有電噴霧電離（ESI）源的ABSCIEX 4000 QTrap 系統(tǒng)上進(jìn)行直接進(jìn)樣質(zhì)譜分析，并以正模式掃描。進(jìn)樣量、流速、質(zhì)樸分析離子噴射電壓、離子源氣體壓力等均參照文獻(xiàn)[5]。共檢測(cè)到23 種氨基酸、35 種肉堿、9 種氨基酸之間的比值、26 種肉堿之間的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 和SIMCA 14.1 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；患者的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后構(gòu)建主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型，用Permutation 驗(yàn)證OPLS-DA 模型的有效性。差異代謝物根據(jù)VIP 值、VIP 置信區(qū)間、差異倍數(shù)進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 STEMI 患者住院及短期隨訪期間（1 個(gè)月）心血管不良事件發(fā)生情況

兩組患者住院時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A 組較B 組短；兩組患者心衰和心律失常發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A 組低于B 組；兩組患者再發(fā)心肌梗死率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。既往文獻(xiàn)顯示心血管不良事件還應(yīng)包括死亡[6-7]，本研究需抽取患者術(shù)后1 個(gè)月血液，因此該類患者除外。

表1 兩組患者住院時(shí)間、心衰、心律失常、再發(fā)心肌梗死的比較

2.2 兩組患者術(shù)后住院期間及術(shù)后1個(gè)月LVEF的比較

兩組患者PCI 術(shù)后住院期間及術(shù)后1 個(gè)月隨訪時(shí)的LVEF 值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），A 組均高于B 組。見表2。

表2 兩組患者術(shù)后住院期間及術(shù)后1個(gè)月LVEF的比較（±s）

表2 兩組患者術(shù)后住院期間及術(shù)后1個(gè)月LVEF的比較（±s）

組別A組n 20術(shù)后住院期間51.70±6.70術(shù)后1個(gè)月52.05±5.91 B組t 值P 值23 44.91±7.20 3.185 0.030 45.30±6.83 3.437 0.010

2.3 代謝輪廓對(duì)疾病狀態(tài)的區(qū)分能力

PCA對(duì)兩組患者入院時(shí)、術(shù)后第2天、術(shù)后1個(gè)月的血漿代謝物進(jìn)行初步分析，得到3 個(gè)PCA 模型。A：入院時(shí)血漿代謝物無分離（見圖1A）；B：術(shù)后第2 天代謝物有一定的區(qū)分趨勢(shì)（見圖1B）；C：術(shù)后1 個(gè)月時(shí)代謝物區(qū)分聚類趨勢(shì)較明顯（R2X =49.6%，Q2 =11.8%）（見圖1C）。術(shù)后1 個(gè)月將患者的代謝物進(jìn)一步構(gòu)建OPLS-DA 模型，該模型能很好地區(qū)分A、B 兩組患者，且模型有較好的擬合性和預(yù)測(cè)能力（R2Y =89.7%，Q2Y =74.2%）（見圖2）。Permutation 實(shí)驗(yàn)證明OPLS-DA 模型是穩(wěn)定的、有效的[截 距：R2 （0.0，0.441） Q2 （0.0，-0.518）]（見圖3）。

圖1 STEMI患者血漿代謝輪廓模型

圖2 術(shù)后1個(gè)月時(shí)OPLS-DA模型

圖3 Permutation實(shí)驗(yàn)

2.4 差異性代謝物的篩選

檢測(cè)到的93 個(gè)代謝物及其含量值全部導(dǎo)入SIMCA 軟件中，OPLS-DA 模型中篩選兩組間變量重要性投影得分（VIP）＞1.0 代謝物（見圖4），且排除系數(shù)圖上置信區(qū)間包含0 的變量（見圖5）；再結(jié)合差異倍數(shù)＜0.833 3 或≥1.2，最終篩選出14 個(gè)差異代謝物，見表3。將所選代謝物與患者術(shù)后1 個(gè)月LVEF 進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析，得出C5、C8、C10、C12、C14∶1、C16、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸與心臟LVEF 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.316、-0.440、-0.322、-0.389、-0.414、-0.283、-0.375、-0.428 和-0.347，P=0.039、 0.003、 0.035、 0.010、 0.006， 0.041，0.047，0.004 和0.023）；C3、C4、C3DC、C5DC、蘇氨酸與LVEF 無相關(guān)性（P＞0.05）。

圖4 VIP圖

圖5 系數(shù)圖

表3 A、B兩組主要差異代謝物

3 討論

近些年來，隨著代謝組學(xué)的興起，其逐漸成為生命科學(xué)不可缺少的研究領(lǐng)域。代謝組學(xué)通過對(duì)血、尿等進(jìn)行檢測(cè)、分析，對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展中伴隨的生化變化有了全新的認(rèn)識(shí)和了解，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志物及病理分子機(jī)制，最終達(dá)到臨床診斷、治療的目的[8-9]。目前代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域。

早期、快速、完全地開通梗死相關(guān)動(dòng)脈，可使缺血心肌迅速恢復(fù)血液灌注，進(jìn)而挽救瀕死心肌，降低心肌梗死危險(xiǎn)程度，縮小心肌梗死面積，避免心臟構(gòu)型發(fā)生改變[10]及維持心功能是STEMI 患者預(yù)后的關(guān)鍵[4]。本研究A 組患者發(fā)病至冠狀動(dòng)脈開通時(shí)間短（≤2 h），心功能接近正常，心血管不良事件發(fā)生較B 組低，與已有報(bào)道一致[6，11]。由于本研究樣本量偏少，且隨訪時(shí)間相對(duì)較短，再發(fā)心肌梗死率在兩組間無差異。由于心衰是STEMI 最常見的并發(fā)癥，也是最重要的預(yù)后不良指標(biāo)之一[12]，而LVEF 是診斷心衰的標(biāo)準(zhǔn)之一，因此又對(duì)兩組患者的LVEF 進(jìn)行比較，同樣無論住院還是院外隨訪期間，及早開通閉塞冠狀動(dòng)脈的A 組的LVEF 值高于B組。通過分析篩選出的A、B 組術(shù)后1 個(gè)月血液差異代謝物與心臟超聲LVEF 進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，代謝物高，超聲指標(biāo)相應(yīng)較差，高代謝物可能與心肌梗死后心功能較差有關(guān)，本研究也主要討論代謝物與心肌梗死后心功能不全這一心血管不良事件的關(guān)系。

亮氨酸、纈氨酸屬支鏈氨基酸（branched chain amino acids, BCAA），BCAA 是人體必需的氨基酸，除了合成蛋白質(zhì)外，還是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)的重要信號(hào)分子。王維等[13]通過復(fù)制小鼠心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后會(huì)發(fā)生BCAA 代謝紊亂，導(dǎo)致BCAA 累積，飼喂BCAA 加重其累積后又發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后的心功能紊亂和心肌重構(gòu)進(jìn)一步加重，這一結(jié)果證明BCAA 累積直接參與了心肌梗死后的心衰進(jìn)程。心肌梗死行PCI 治療后，組織細(xì)胞損傷加重，即缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI）[14-15]。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是IRI 的主要發(fā)生機(jī)制[16]，活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）在其中扮演極其重要的角色。廉坤通過小鼠模型證實(shí)，高BCAA 血癥加重小鼠心肌IRI，增加ROS 水平，即高BCAA 血癥有心臟“毒性”作用，且該作用與氧化應(yīng)激有關(guān)[13]。DU 等運(yùn)用靶向質(zhì)譜法測(cè)定PCI 術(shù)后發(fā)生心血管不良事件和未發(fā)生心血管不良事件的STEMI 患者入院時(shí)26 種氨基酸代謝產(chǎn)物的濃度，確定BCAA 在區(qū)分有心血管不良事件和無心血管不良事件的患者中具有極高的價(jià)值。并推測(cè)這一現(xiàn)象與先前研究確定的BCAA 分解代謝異常與心肌梗死和IRI 之間的相關(guān)性有關(guān)[17-18]。STEMI患者血管重建時(shí)間延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞受損程度要高于及時(shí)進(jìn)行血運(yùn)重建者，細(xì)胞缺血、缺氧更重，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，加上心肌梗死發(fā)生時(shí)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，引發(fā)心肌細(xì)胞更顯著的自噬效應(yīng)來降解蛋白質(zhì)為氨基酸以維持心臟功能和活力[19-20]，因此本研究得出亮氨酸、纈氨酸含量在B 組含量相對(duì)較高。

肉堿是一種親水性氨基酸衍生物，以游離肉堿和?；鈮A兩種形式存在，有L-肉堿（有生物活性）及D-肉堿兩種異構(gòu)體。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈閉塞后，脂肪酸將升高；脂肪酸的累積會(huì)損傷線粒體功能和呼吸鏈，不能進(jìn)入線粒體進(jìn)行能量代謝，進(jìn)而導(dǎo)致?；鈮A的累積。本研究發(fā)現(xiàn)C10、C12 等?；鈮A在B 組含量較高，可能與B 組患者心肌缺血、缺氧時(shí)間更長(zhǎng)有關(guān)。LIEPINSH 等[21]通過復(fù)制動(dòng)物心肌IRI 模型發(fā)現(xiàn)，酰基肉堿積聚到足夠濃度能抑制線粒體氧化磷酸化，刺激線粒體ROS的產(chǎn)生，損傷線粒體并增加心肌梗死面積，從而得出在線粒體中抑制?；鈮A的產(chǎn)生有可能是一個(gè)有價(jià)值的心臟保護(hù)藥物靶點(diǎn)的結(jié)論。還有研究證實(shí)，升高的長(zhǎng)鏈?；鈮A類物質(zhì)會(huì)損害生物膜、鈉泵及鈣泵，導(dǎo)致膜的脂質(zhì)雙分子層流動(dòng)性降低、細(xì)胞腫脹、鈣超載等，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]。血液中肉堿積聚對(duì)心肌梗死后心功能產(chǎn)生不利影響，然而補(bǔ)充肉堿后可令心肌梗死后心肌獲益。XUE等[23]通過復(fù)制小鼠IRI 模型發(fā)現(xiàn)，再灌注前腹腔注射左旋肉堿，可顯著改善心臟功能;進(jìn)一步研究表明這一機(jī)制可能與激活PI3K 通路有關(guān)，上調(diào)p-Akt 和Bcl-2（抗凋亡）蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax-2（抑制Bcl2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡）蛋白的表達(dá)，抑制IRI期細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，越早開通STEMI 患者閉塞冠狀動(dòng)脈，預(yù)后越好，較高的代謝物亮氨酸、纈氨酸及長(zhǎng)鏈?；鈮A等與心肌梗死后心功能不全有關(guān)。從代謝組學(xué)方面深化了對(duì)STEMI 患者及早進(jìn)行血管重建的認(rèn)識(shí)，并對(duì)心肌梗死后心功能不全的可能發(fā)生機(jī)制從代謝組學(xué)方面找到了新的研究方向。本研究由于樣本量偏少，隨訪時(shí)間較短，且樣本行代謝組學(xué)檢測(cè)本身受多種因素影響，有其局限性，因此有待于深入研究。