袁銘銘，姚閩，雷景邦

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西省藥品監(jiān)督管理局，江西 南昌 330029

艾葉Artemisiae ArgyiFolium 來源于菊科蒿屬植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的干燥葉，具有散寒止痛，溫經(jīng)止血的功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，艾葉的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、黃酮類以及三萜類等［2-5］。艾葉具有平喘鎮(zhèn)咳、抗病毒、解熱鎮(zhèn)靜、止血、祛痰、抗凝血、抗菌、抗氧化等作用［4-6］。艾絨是由艾葉料剔除塵土粗梗、粉碎、然后過篩篩除葉肉、葉梗以及葉脈等粉末得到篩上層艾絨［7］，目前市場上出售的艾絨，多數(shù)標(biāo)以比例2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、30∶1 等標(biāo)簽，如葉絨比2∶1的表示為將2 kg 的艾葉制備得到1 kg 的艾絨，即艾絨在炮制過程中篩除掉的雜質(zhì)越多，得到的艾絨的量越低，艾絨的純度越高，一般質(zhì)量越好。而目前對于艾絨質(zhì)量的研究較少。本研究為艾絨建立穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確的鑒別和含量測定方法，填補(bǔ)該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下空白項(xiàng)，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），Agilent 1260 型高效液相色譜儀（HPLC）（美國Agilent 公司），XSE-205 型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），ME204TE 型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 主要藥品與試劑

異澤蘭黃素（批號：CFN99117，純度99.2%）對照品購于上海洽姆儀器科技有限公司；艾葉（批號：121345-201804）對照藥材購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（SIGMA 公司）為色譜純；水為去離子超純水，其他試驗(yàn)用試劑試藥均為分析純。

本研究共收集艾葉藥材5 批，分別來自江西贛州（1 批）、湖北蘄春（1 批）、湖北隨州（1 批）和河南南陽（2 批），所有藥材經(jīng)鑒定均為菊科植物艾的干燥葉。參考艾絨制備工藝流程，本研究采用DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機(jī)將各批次艾葉粉碎，將粉碎的艾葉過篩，通過過篩后剩余艾絨的質(zhì)量制成不同葉絨比的艾絨飲片，具體艾絨信息見表1。

表1 20批不同葉絨比等級的艾絨信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 稱取艾絨樣品1 g，加石油醚（60～90 ℃）25 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，用正己烷1 mL 使溶解，即得。

2.1.2 對照藥材溶液制備 取艾葉對照藥材1 g，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備對照藥材溶液，即得。

2.1.3 方法與結(jié)果 照《中國藥典》（2020 年版四部附錄）薄層色譜法［8］試驗(yàn)，分別吸取艾葉對照藥材溶液和供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）作為展開劑，2%香草醛硫酸溶液為顯色劑，并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢測，在和艾葉對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。經(jīng)過驗(yàn)證，該方法斑點(diǎn)分離度較好、斑點(diǎn)清晰，可作為艾絨的專屬性鑒別方法，色譜圖如圖1 所示。

圖1 艾絨與對照藥材的薄層色譜圖

2.2 高效液相含量測定

2.2.1 溶液制備（1）艾絨樣品溶液的制備：取艾絨樣品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再次稱重，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）異澤蘭黃素對照品溶液的制備：精密稱取異澤蘭黃素對照品18.85 mg，置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取上述異澤蘭黃素對照品溶液5 mL 置于50 mL 容量瓶中，用80%甲醇使溶解并定容，搖勻，即得每1 mL 含異澤蘭黃素濃度為0.018 7 mg/mL 的對照品溶液。（3）空白溶液的制備：以供試品的提取溶液（80%甲醇溶液）作為空白溶液。

2.2.2 色譜條件 采用CAPCELL PAK C18MG Ⅱ S5（4.6 mm×250 mm,5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）為流動相；流動相流速為1.0 mL/min；設(shè)定波長為344 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.3 專屬性考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液、異澤蘭黃素對照品溶液以及空白溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果如圖2 所示，待測成分的色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)按異澤蘭黃素色譜峰計(jì)不低于5 000；空白溶液對待測成分均無干擾，表明該方法專屬性好。

圖2 艾絨的HPLC色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)稀釋后的對照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，分別按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以異澤蘭黃素的進(jìn)樣量（x，μg）作為橫坐標(biāo)，測得的峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性關(guān)系考察，得回歸方程Y=3 188.693 3X+4.759 6，r=0.999 9。結(jié)果表明，異澤蘭黃素在0.018 7～0.561 μg 和峰面積具有較好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取異澤蘭黃素對照品溶液10 μL，照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，異澤蘭黃素峰面積的RSD（n=6）為0.35%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一艾絨樣品（編號AR-1）6 份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備艾絨樣品溶液，然后按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定峰面積，記錄每份樣品的峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算艾絨樣品中異澤蘭黃素的含量。結(jié)果測得異澤蘭黃素的平均含量（n=6）為1.747 mg/g，RSD 為0.71%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一艾絨樣品（編號AR-1），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備艾絨樣品溶液，分別與制備后在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 后照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果，異澤蘭黃素峰面積的RSD（n=6）0.50%，表明該艾絨樣品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的艾絨樣品（編號AR-1）6 份，每份0.25 g，精密稱定，分別按已知量的100%加入含異澤蘭黃素（0.009 35 mg/mL）的溶液50 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備回收率樣品溶液，然后照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 艾絨中異澤蘭黃素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 艾絨樣品含量測定 取20 批艾絨樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備艾絨樣品溶液，然后照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法分別計(jì)算艾絨樣品中異澤蘭黃素的含量，結(jié)果見表3。

表3 艾絨中異澤蘭黃素的含量結(jié)果（n=3，mg/g）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別項(xiàng)

通過考察石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（3∶1）、三氯甲烷-甲醇（15∶1）以及石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）三個不同展開劑系統(tǒng)，結(jié)果顯示石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）作為展開劑分離效果最好。

3.2 含量測定項(xiàng)

3.2.1 樣品提取方法的優(yōu)化 本研究分別采用30%

甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇為提取溶劑對艾絨樣品進(jìn)行提取。結(jié)果顯示，以80%甲醇為提取溶劑時，異澤蘭黃素色譜峰的分離度較好，且含量最高，因此選擇80%甲醇作為艾絨樣品的提取溶劑。又分別考察了超聲提取和回流提取兩種提取方法對艾絨樣品中異澤蘭黃素的影響，發(fā)現(xiàn)回流提取的色譜峰峰面積明顯大于超聲提取，含量更高，故本研究選擇回流提取的方式作為艾絨樣品的提取方式。此外，考察不同提取時間（30、60、90 min），不同料液比（1∶50、1∶100、1∶200 g/mL）對異澤蘭黃素含量的影響，最終擇優(yōu)選擇提取時間60 min、料液比1∶50（g/mL）。

3.2.2 色譜條件的優(yōu)化 本研究考察了4 種流動相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液）進(jìn)行了色譜條件的摸索。發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）作為流動相時，樣品圖譜中異澤蘭黃素的色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）作為流動相。同時，采用DAD檢測器在200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，異澤蘭黃素在為344 nm 附近有最大吸收，且色譜峰與其余色譜峰分離良好，基線較平，故最終選擇344 nm 作為檢測波長。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)：（1）建立了艾絨薄層鑒別方法，該法斑點(diǎn)清晰，分離度好；（2）測定了20 批不同葉絨比艾絨中含量，結(jié)果不同批次的含量差異較明顯，同時呈現(xiàn)出葉絨比越大，含量越低，這可能與艾絨在加工制備時需要不斷的過篩，篩除掉艾粉和艾渣，艾粉主要為艾葉的葉肉組織，其內(nèi)含有大量的有機(jī)成分。因此，葉絨比越大的艾絨，所含的雜質(zhì)和艾粉越少，異澤蘭黃素含量就越低。本實(shí)驗(yàn)所建立的定性定量方法為進(jìn)一步完善艾絨的質(zhì)量評價方法提供參考依據(jù)。