南紅星，禹劉麗，王良海

食管癌作為全球病死率排名第6位的惡性腫瘤，每年有近51萬(wàn)例患者死亡[1]，其中約一半為中國(guó)患者[2]。食管鱗癌是國(guó)內(nèi)食管癌的主要病理亞型，隨著生活條件的改善和醫(yī)療水平的提高，食管鱗癌患者的病死率有所降低，但轉(zhuǎn)移性食管鱗癌患者的預(yù)后仍不理想[3]。轉(zhuǎn)移成為食管鱗癌患者預(yù)后差的主要原因之一，尋找食管鱗癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的潛在機(jī)制，對(duì)提高食管鱗癌患者的生存有積極意義。趨化因子是一類小細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)特異細(xì)胞趨化轉(zhuǎn)移，一系列趨化因子被報(bào)道參與腫瘤的惡性進(jìn)展[4-5]，其中CCL20不僅在黑色素瘤、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用[4,6]，還在多種腫瘤中高表達(dá)，并且和腫瘤分級(jí)以及患者的累積生存時(shí)間密切相關(guān)[7]。但是CCL20在食管鱗癌中的研究卻很少，該研究探討CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性的影響，并初步探索了CCL20的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌細(xì)胞株：ECA109和EC9706來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑： RMPI 1640培養(yǎng)液和超敏ECL底物發(fā)光試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Thermo Fisher公司，G418藥物及Western blot實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)自中國(guó)索萊寶科技有限公司，胎牛血清生產(chǎn)于以色列 Bioind公司，ERK、NF-κB、STAT3 和AKT信號(hào)通路抑制劑購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，CCK8試劑購(gòu)自北京北仁化學(xué)科技有限公司，Transwell小室及Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司，CCL20抗體(1 ∶1 000,# ab9829)購(gòu)自英國(guó)Abcam抗體公司，p-ERK1/2(1 ∶1 000,#4370) 抗體及ERK1/2(1 ∶1 000,#4695)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，所有使用質(zhì)粒均合成于中國(guó)吉瑪公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 使用含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ECA109和EC9706細(xì)胞。含有CCL20的質(zhì)粒和靶向CCL20的shRNA(shCCL20)質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，CCL20過(guò)表達(dá)組為轉(zhuǎn)染了CCL20質(zhì)粒的細(xì)胞，CCL20干擾組是轉(zhuǎn)染了shCCL20質(zhì)粒的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后使用濃度為500 ng/L的G418 藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，之后通過(guò) Western blot或者實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2蛋白提取與Western blot實(shí)驗(yàn) 使用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min，4 ℃條件下13 000 r/min離心20 min，取離心上清測(cè)濃度。電泳到蛋白分離開(kāi)，用半干轉(zhuǎn)儀器轉(zhuǎn)膜，室溫?fù)u床封閉膜2 h后，于4 ℃結(jié)合一抗過(guò)夜。二抗結(jié)合2 h后洗膜曝光。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增后，檢測(cè)CCL20 mRNA的表達(dá)水平，β肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照，使用的引物序列CCL20 F：5′-GCGAA TCAGAAGCAAGCAACT-3′， R:5′-TTGGATTTGCGC ACACAGAC-3′；β-actin F:5′-AAGGATTCCTATGTGG GCGAC-3′，R:5′- CGTACAGGGATAGCACAGCC-3′。

1.2.4Transwell 遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 上室加細(xì)胞懸液200 μl，遷移實(shí)驗(yàn)接種細(xì)胞數(shù)目為3×104個(gè)/孔，侵襲實(shí)驗(yàn)接種細(xì)胞數(shù)目為1.5×104個(gè)/孔，下室為含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，胎牛血清作為化學(xué)誘導(dǎo)物。遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間為1 d，侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間為2 d。侵襲實(shí)驗(yàn)的小室需要用45 μl 稀釋的基質(zhì)膠包被。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)小室置于200×放大率的鏡下，隨機(jī)拍取至少5張結(jié)晶紫染色細(xì)胞圖片，計(jì)數(shù)后統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5CCK8實(shí)驗(yàn) 鋪96孔板后，于0、24、48和72 h時(shí)每孔加入CCK8試劑10 μl，放回培養(yǎng)箱2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.1.1建立CCL20過(guò)表達(dá)細(xì)胞株 與對(duì)照組細(xì)胞比較，過(guò)表達(dá)CCL20的ECA109細(xì)胞和EC9706細(xì)胞表達(dá)的CCL20蛋白增多，表示CCL20過(guò)表達(dá)細(xì)胞株成功建立。見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)CCL20后ECA109和EC9709細(xì)胞中CCL20蛋白的表達(dá)情況

2.1.2CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組細(xì)胞比較，過(guò)表達(dá)CCL20的ECA109細(xì)胞和EC9709細(xì)胞遷移穿過(guò)聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù)目增多[(49.73±23.02)個(gè)vs(178.80±36.79)個(gè)][(108.40±25.16)個(gè)vs(43.40±8.52)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.15、4.239，P<0.01、<0.05)，表明過(guò)表達(dá)CCL20增加食管鱗癌細(xì)胞遷移能力。見(jiàn)圖2。

圖2 過(guò)表達(dá)CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移的影響 ×200

2.1.3CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組細(xì)胞比較，過(guò)表達(dá)CCL20的ECA109細(xì)胞和EC9709細(xì)胞侵襲穿過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)目增多[(160.70±14.64)個(gè)vs(38.13±14.85)個(gè)][(251.20±34.02)個(gè)vs(67.47±11.04)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.17、8.901,均P<0.001)，表明過(guò)表達(dá)CCL20增加食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力。見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲的影響 ×200

2.2 CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響過(guò)表達(dá)CCL20的ECA109和EC9706細(xì)胞吸光度在24 h(0.380±0.024)(0.316±0.012)，48 h(0.768±0.014)(0.462±0.005)和72 h(1.496±0.133)(0.858±0.031)時(shí)，與對(duì)照組細(xì)胞吸光度24 h(0.344±0.012)(0.286±0.009)，48 h(0.657±0.009)(0.447±0.004)和72 h(1.323±0.0587)(0.7886±0.0386)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.264、 11.680、 2.067，均P>0.05)(t=3.450、3.984、2.431，均P>0.05)，提示CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖4。

圖4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)CCL20后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 干擾CCL20對(duì)食管鱗癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.3.1建立CCL20干擾細(xì)胞株 靶向CCL20的3組shRNA(shCCL20#1、2、3)均能降低EC9706細(xì)胞中的CCL20 mRNA的表達(dá)水平，尤其shCCL20#3組干擾效率最高。見(jiàn)圖5。

圖5 實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示不同shCCL20質(zhì)粒的干擾效果

2.3.2干擾CCL20表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移侵襲的影響 與對(duì)照組細(xì)胞比較，干擾CCL20表達(dá)的EC9706細(xì)胞遷移和侵襲穿過(guò)Transwell聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù)目均降低[(75.67±9.74)個(gè)vs(28.20±4.74)個(gè)][(81.00±13.67)個(gè)vs(24.57±8.36)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.590、6.101,均P<0.01)，提示干擾CCL20表達(dá)后食管鱗癌細(xì)胞遷移侵襲能力下降。見(jiàn)圖6。

圖6 干擾CCL20表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 ×200

2.4 CCL20的下游通路探討

2.4.1抑制ERK通路對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移侵襲的影響 ERK1/2特異性抑制劑(SCH772984)(1 μmol/L)處理EC9706細(xì)胞1～2 d后， 與CCL20組比較，CCL20+抑制劑組遷移和侵襲通過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)目減少[(208.30±42.13)個(gè)vs(83.00±21.82)個(gè)][(212.70±72.53)個(gè)vs(53.43±9.93)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.575、3.769,均P<0.05)。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.94、17.22,P<0.001)，見(jiàn)圖7。

圖7 抑制ERK通路對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響 ×200

2.4.2過(guò)表達(dá)或者干擾CCL20對(duì)ERK蛋白的影響 與對(duì)照組細(xì)胞比較，過(guò)表達(dá)CCL20的 EC9706細(xì)胞中ERK1/2蛋白磷酸化激活水平增加，干擾CCL20表達(dá)后， ERK1/2蛋白的磷酸化激活水平下降。見(jiàn)圖8。

圖8 過(guò)表達(dá)或者干擾CCL20對(duì)ERK蛋白的影響

3 討論

轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)一直是食管鱗癌患者死亡的主要原因，關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究很多，然而至今也不能完全闡明腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。但是腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和趨化因子有密切關(guān)系，趨化因子可以通過(guò)招募特異型免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境[8]，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植后的存活提供支持，還可以促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

CCL20和其它趨化因子一樣，可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞的趨化轉(zhuǎn)移，在腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮作用。有研究[9]報(bào)道CCL20可以招募Treg細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)直腸癌的化療抵抗，在食管鱗癌中，CCL20可以招募Treg細(xì)胞促進(jìn)食管鱗癌的進(jìn)展，并且CCL20表達(dá)高的患者的預(yù)后更差[10]。另外，CCL20在多種腫瘤中作為危險(xiǎn)因子促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，例如促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[11]，在乳腺癌中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[12]。但是未發(fā)現(xiàn)CCL20與食管鱗癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究，本研究對(duì)CCL20在食管鱗癌細(xì)胞中的作用及其潛在的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CCL20后，食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，干擾CCL20的表達(dá)可以抑制食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲，表明CCL20可以增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，增加食管鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。為了尋找CCL20促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的下游信號(hào)通路，本研究檢測(cè)了ERK信號(hào)通路特異性抑制劑(SCH772984,1 μmol/L)處理對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲遷移的影響，結(jié)果ERK1/2特異性通路抑制劑處理顯著降低了食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這意味著CCL20可能是通過(guò)ERK通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了過(guò)表達(dá)CCL20后ERK1/2蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CCL20后，ERK1/2蛋白的磷酸化水平增加，干擾CCL20的表達(dá)后，ERK1/2的磷酸化水平降低，這些結(jié)果表明過(guò)表達(dá)CCL20后，ERK通路異常激活，干擾CCL20后，ERK通路的激活受到抑制，進(jìn)一步印證了CCL20通過(guò)激活ERK通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究增加了人們對(duì)食管鱗癌轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制的了解，提示CCL20可能在食管鱗癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為食管鱗癌患者的治療提供了新的方向。