葉廣彬，羅世官，張忠偉，黃 偉，凌 博

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中80%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。肺癌患者確診時(shí)多為中晚期，且存在不同程度的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致化療、手術(shù)治療等常規(guī)治療方法的效果不理想，患者的5年生存期為10%～15%[1-4]。目前，病理活檢為診斷肺癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其有創(chuàng)性、重復(fù)性差和腫瘤異質(zhì)性等因素制約了肺癌臨床診斷[5]。以分子標(biāo)記物為代表的“液體活檢”技術(shù)，成為解決上述問題的方案之一[6]。miR-22定位于人17號(hào)染色體上的17p13.3區(qū)域，在不同腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)差異，參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等進(jìn)程[7]。血清miR-22在不同臨床特征的NSCLC中出現(xiàn)差異化表達(dá)，具備作為輔助診斷NSCLC的生物標(biāo)記物[8]。但miR-22與NSCLC臨床各指標(biāo)的相關(guān)性，以及在NSCLC預(yù)后中的價(jià)值尚不清楚。因此，該研究聚焦血清miR-22水平與NSCLC各臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，探討血清miR-22檢測(cè)在NSCLC中的臨床價(jià)值，以便通過液體活檢技術(shù)為NSCLC患者的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和重慶市人民醫(yī)院2010—2015年確診的276例NSCLC患者臨床資料，其中男性119例，女性157例，年輕患者31例(年齡≤50歲)，老年患者245例(年齡>50歲)。根據(jù)腫瘤原發(fā)部位分組，其中原發(fā)部位肺上葉113例、肺下葉137例、肺中葉12例、肺部但無(wú)法確定具體位置14例；根據(jù)腫瘤原發(fā)偏側(cè)性分組，其中左側(cè)113例、右側(cè)163例；根據(jù)腫瘤分化分組，其中高分化135例、低分化35例、中分化106例；根據(jù)非小細(xì)胞肺癌AJCC分期第7版[9]，進(jìn)行TNM分期，T分期中T1為104例、T2為81例、T3為59例、T4為32例；N分期中N0為194例、N1為19例、N2為49例、N3為14例；M分期中M0為210例，M1為66例；根據(jù)轉(zhuǎn)移部位分組，其中肺內(nèi)轉(zhuǎn)移34例、肺癌肝轉(zhuǎn)移11例、肺癌腦轉(zhuǎn)移12例、肺癌骨轉(zhuǎn)移19例。納入的健康人群168例，其中男性70例，女性98例，年輕群體18例(年齡≤50歲)，老年群體150例(年齡>50歲)。健康人群和NSCLC患者在年齡和性別方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

健康人群準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過常規(guī)體檢包括胸部CT等檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤類疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：過往病歷資料中出現(xiàn)過慢性支氣管炎、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺炎等慢性呼吸系統(tǒng)疾病和心腦血管疾病。NSCLC患者準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)組織病理活檢或細(xì)胞病理檢測(cè)確診為原發(fā)NSCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：多原發(fā)癌、臨床隨訪資料不完整或缺失、過往有腫瘤病史、確診前進(jìn)行化療或放療。

1.2 主要試劑EDTA抗凝管購(gòu)于美國(guó)BD公司；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；miRNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)樣本中miR-22的表達(dá)采集NSCLC患者和健康人群在入院當(dāng)天空腹靜脈血4 ml，應(yīng)用抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀并離心10 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，取上清，應(yīng)用miRNA提取試劑盒按照其操作程序提取血清樣本中的miRNA。參照miRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒的說明書，對(duì)miRNA的3′端poly(A)化和逆轉(zhuǎn)錄，其中以cDNA為模板，以miR-103a為內(nèi)參，應(yīng)用miRNA熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果判讀中，miR-22的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt來(lái)確定。各組血清樣本中的△Ct=Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因，Ct代表熱循環(huán)儀在反應(yīng)體系中檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度值。

miR-22引物序列為F:5′-GGGGGATCCCTGGG GCAGGACCCT-3′；R:5′-GGGGAATTCAACGTATCAT CCACCC-3′。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者和健康人群血清中miR-22表達(dá)量變化NSCLC患者血清miR-22的平均表達(dá)量為(5.34 ±1.68)，健康人群血清miR-22的平均表達(dá)量為(2.85±0.73)。NSCLC患者血清miR-22的表達(dá)量明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者血清中miR-22表達(dá)量的變化在年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤原發(fā)偏側(cè)性、T分期、肺癌腦轉(zhuǎn)移中，NSCLC患者血清miR-22表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05)；在腫瘤分化因素中，不同分化程度的患者血清miR-22水平有差異，其中低分化患者血清miR-22表達(dá)量高于高分化患者(P<0.05)；在N分期因素中，不同N分期的患者血清miR-22水平有差異，其中N3、N2期患者血清miR-22表達(dá)量高于N1、N0期(P<0.05)；在M分期因素中，M1期患者血清miR-22表達(dá)量高于M0期(P<0.05)；在肺癌骨轉(zhuǎn)移因素中，肺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清miR-22表達(dá)量高于未骨轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)；在肺癌肝轉(zhuǎn)移因素中，肺癌肝轉(zhuǎn)移患者血清miR-22表達(dá)量高于未肝轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)；在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移因素中，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移患者血清miR-22表達(dá)量高于未肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征NSCLC患者血清中miR-22表達(dá)量的變化

2.3 NSCLC患者中血清miR-22表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性以NSCLC患者血清miR-22平均表達(dá)量5.34進(jìn)行分組，血清miR-22表達(dá)量>5.34為miR-22高表達(dá)組，血清miR-22表達(dá)量≤5.34為miR-22低表達(dá)組。結(jié)果NSCLC患者血清miR-22表達(dá)的高低與N分期、M分期、肺癌肝轉(zhuǎn)移和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05)。N2期、N3期、M1期、肺癌肝轉(zhuǎn)移和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者更易出現(xiàn)miR-22高表達(dá)。見表2。

表2 NSCLC臨床特征與血清miR-22水平的相關(guān)性分析[n(%)]

2.4 生存分析血清miR-22水平對(duì)NSCLC預(yù)后的影響miR-22低表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后優(yōu)于miR-22高表達(dá)的患者，見圖1。對(duì)患者的生存率和生存時(shí)間進(jìn)行分析可知，miR-22低表達(dá)患者1、3、5年生存率和平均生存時(shí)間均高于miR-22高表達(dá)患者(P<0.05)，見表3、4。

圖1 NSCLC患者血清miR-22水平與預(yù)后的相關(guān)性分析

表3 NSCLC患者血清miR-22水平與總生存率、生存時(shí)間的相關(guān)性分析

表4 NSCLC患者血清miR-22水平與腫瘤特異性生存率、生存時(shí)間的相關(guān)性分析

2.5 Cox多因素分析血清miR-22與NSCLC預(yù)后的相關(guān)性Cox多因素分析結(jié)果表明，T分期、M分期、肺癌骨轉(zhuǎn)移、血清miR-22水平是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。T3期、T4期、M1期、肺癌骨轉(zhuǎn)移和血清miR-22高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后較差。見表5。

表5 NSCLC患者預(yù)后的Cox多因素分析

3 討論

“液體活檢”技術(shù)的興起，成為肺癌等惡性腫瘤臨床診斷的有效途徑之一。液體活檢具備無(wú)創(chuàng)性、呈現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性、實(shí)時(shí)性(監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)程和預(yù)后)等優(yōu)點(diǎn)，符合現(xiàn)代腫瘤“個(gè)性化治療”的臨床需要[10]。在液體活檢技術(shù)中，以miRNA為代表的外周血分子診斷標(biāo)記物，具備敏感性高和穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，但缺乏其與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性研究，從而限制了其進(jìn)一步開發(fā)[11]。因此，本研究試圖以血清miR-22水平與NSCLC患者臨床特征、預(yù)后的相關(guān)性入手，為miRNA在腫瘤液體活檢中的開發(fā)提供可行性的方法和依據(jù)。

miR-22與NSCLC關(guān)系密切。多項(xiàng)研究指出[12-13]，miR-22通過抑制下游靶基因(癌基因)的轉(zhuǎn)錄后翻譯環(huán)節(jié)，從而減少癌基因的表達(dá)，抑制NSCLC細(xì)胞的遷移、增殖。從血清表達(dá)水平的研究出發(fā)，不難發(fā)現(xiàn)miR-22在NSCLC患者的外周血中出現(xiàn)顯著高表達(dá)，尤其在腫瘤分化、TNM分期、轉(zhuǎn)移等因素中出現(xiàn)差異化表達(dá)[14]。本研究中在不同臨床特征NSCLC患者血清miR-22表達(dá)也證實(shí)了以上觀點(diǎn)。由此，miR-22參與了NSCLC的進(jìn)程，且在不同臨床特征患者中出現(xiàn)差異表達(dá)，這為miR-22開發(fā)成NSCLC液體活檢中的分子靶標(biāo)提供了依據(jù)。

目前miR-22與NSCLC患者臨床特征的分析，主要集中在不同臨床特征患者血清miR-22表達(dá)量，無(wú)法全面揭示miR-22與NSCLC臨床特征的相關(guān)性[15]。因此，本研究中以NSCLC患者血清miR-22平均表達(dá)量分組，分析血清miR-22水平高低與臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，血清miR-22水平高低與NSCLC患者N分期、M分期、肺癌肝轉(zhuǎn)移和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，且N2期、N3期、M1期、肺癌肝轉(zhuǎn)移和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者更易出現(xiàn)miR-22高表達(dá)。此研究結(jié)果證實(shí)，血清miR-22水平與NSCLC患者的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

最新研究指出[16]，血清miR-22水平與NSCLC患者的總生存率和無(wú)病生存率具有相關(guān)性。然而血清miR-22在NSCLC患者預(yù)后中的價(jià)值還需進(jìn)一步明確。因而，本研究納入腫瘤特異性存活時(shí)間和總存活時(shí)間兩個(gè)預(yù)后關(guān)鍵指標(biāo)，進(jìn)行評(píng)價(jià)血清miR-22水平在NSCLC預(yù)后中的價(jià)值。結(jié)果表明miR-22低表達(dá)患者1、3、5年生存率和平均生存期均高于miR-22高表達(dá)患者。由此，miR-22低表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后優(yōu)于miR-22高表達(dá)的患者。為了進(jìn)一步挖掘血清miR-22水平在NSCLC預(yù)后中的價(jià)值，本研究利用Cox多因素回歸分析的方法，納入了年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、偏側(cè)性、TNM分期、分級(jí)、肺癌骨轉(zhuǎn)移和miR-22水平等因素，證實(shí)了血清miR-22水平是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因素。以上結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了，血清miR-22水平可作為NSCLC預(yù)后分析的可靠性指標(biāo)之一。