劉 靜,陳惠榮,郭佳琦,馬金海

B淋巴細(xì)胞又稱骨髓依賴性淋巴細(xì)胞，由骨髓中的造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來，在人體內(nèi)合適環(huán)境刺激下增殖分化為漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞，而漿細(xì)胞合成和分泌免疫球蛋白，在體液免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[1]。近十年，有越來越多的實(shí)驗(yàn)研究B細(xì)胞在體外增殖分化為漿細(xì)胞的步驟，但過程繁瑣且周期長[2-3]。該研究用3個(gè)步驟建立從B細(xì)胞增殖分化成漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞的體外模型，這種體外模型有助于對漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞的功能進(jìn)一步研究，也為研究多發(fā)性骨髓瘤一類漿細(xì)胞發(fā)育不良疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料健康捐獻(xiàn)者外周血單個(gè)核細(xì)胞，用CD19 MicroBeads human Isolation Kit分離B細(xì)胞，純度>95%。接種于24孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分為CD40L對照組及CD40L+CpG組，每孔2 ml培養(yǎng)液,B細(xì)胞濃度為1.5×103個(gè)/L。標(biāo)本已獲得健康捐贈者知情同意。

1.2 試劑與儀器CpG、白細(xì)胞介素(interleukin)-2、IL-4、IL-6、IL-21、干擾素α(interferon-α，IFN-α)、April、抗體CD19-PercP-Cy、CD27-PE/Cy7、CD38-APC、CD24-PE、CD138-N421、CD20-FITC、Fc block、培養(yǎng)液均購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；BD LSR Ⅱ流式細(xì)胞檢測儀購自美國BD公司；超凈工作臺購自蘇州市潔凈技術(shù)研究所；臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；溫水浴鍋和恒溫箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化B細(xì)胞的增殖和分化。步驟1：B細(xì)胞激活，將純化的B細(xì)胞以1.5×103個(gè)/L濃度置于24孔板的RPMI1640培養(yǎng)液，10% FBS，以0.002 L/孔培養(yǎng)細(xì)胞。加入CD40L(0.05 μg/L)、IL-2(0.05 μg/L)、IL-4(0.05 μg/L)或CD40L(0.05 μg/L)、CpG (0.01 μg/L)、IL-2(0.05 μg/L)、IL-4(0.05 μg/L)培養(yǎng)4 d。步驟2：漿母細(xì)胞分化，在培養(yǎng)第4天，收集細(xì)胞并用培養(yǎng)液清洗，去除CD40L、CpG，加入細(xì)胞因子組合：IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)或IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、IL-21(0.05 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)促進(jìn)漿細(xì)胞分化3 d。步驟3：漿細(xì)胞分化，在培養(yǎng)第7天，洗滌細(xì)胞，分別以IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、April(0.02 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)或IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、IL-21(0.05 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)培養(yǎng)3 d，整個(gè)過程共10 d。

1.3.1倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)期B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 B細(xì)胞激活后體積逐漸增大，在第7天及第10天觀察細(xì)胞形態(tài)變化。在每一個(gè)步驟結(jié)束用臺盼藍(lán)對細(xì)胞生存率進(jìn)行測定。

1.3.2流式細(xì)胞儀分析 通過熒光素FITC結(jié)合抗CD20抗原，PE結(jié)合抗CD38抗原進(jìn)行多色熒光激活細(xì)胞分選,對第7天漿母細(xì)胞(CD20-CD38+)進(jìn)行染色。使用FITC結(jié)合抗CD20和PE結(jié)合抗CD138抗原對第10天的漿細(xì)胞(CD20-CD138+)進(jìn)行染色。在BD LSR Ⅱ流式細(xì)胞儀上直接免疫熒光染色分析細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化B細(xì)胞的增殖和分化用CD40L、CpG、IL-2、IL-4激活B細(xì)胞4 d。去除CD40L及CpG，加入IL-2、IL-21促進(jìn)漿母細(xì)胞分化3 d。加入IL-2、IL-6、IFN-α、April促進(jìn)漿細(xì)胞分化3 d，得到漿細(xì)胞數(shù)量及活性最佳。見表1。

2.2 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化第7天及第10天倒置顯微鏡下可見B細(xì)胞在分化過程中，形態(tài)由球形變?yōu)椴灰?guī)則形，胞質(zhì)豐富，表面光滑，由分散生長逐漸到成簇生長。CD40L組及CD40L+CpG組均可見大量B細(xì)胞增殖，在第7天細(xì)胞存活率均在80.0%以上，而第10天大量細(xì)胞死亡，存活率降至39.0%。

2.3 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面分子表達(dá)水平檢測步驟1：從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得純化的B細(xì)胞，用CD40L+CpG、IL-2、IL-4激活B細(xì)胞獲得大量活性B細(xì)胞。CD40L和CpG同時(shí)刺激B細(xì)胞激活時(shí)，增殖能力會大大增強(qiáng)，并且誘導(dǎo)漿母細(xì)胞分化。第4天擴(kuò)增的細(xì)胞中得到40.2% CD20+CD38-細(xì)胞，12.6% CD20-CD38++細(xì)胞，3.9% CD20-CD38+CD138++細(xì)胞。步驟2：在這個(gè)階段CD40L及CpG可以阻止?jié){細(xì)胞進(jìn)一步分化，故首先去除CD40L及CpG，而IL-2、IL-21可促進(jìn)漿母細(xì)胞分化和存活。如果在步驟1中用CD40L培養(yǎng)細(xì)胞，第7天細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，但在第7天抗CD20、CD38、CD138抗原標(biāo)記細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)CD20+CD38-細(xì)胞的百分比從40.2%降至10.6%(P=0.000 1，t=0.19),此外還檢測到19.8% CD20-CD38+CD138++細(xì)胞。對比使用不同的細(xì)胞因子組合，加用IL-6及IFN-α組在細(xì)胞形態(tài)及生長情況無明顯差異，得到10.6% CD20+CD38-細(xì)胞(P=0.95,t=0.74)，57.9% CD20-CD38++細(xì)胞(P=0.91,t=0.76)，19.8% CD20-CD138++細(xì)胞(P=0.90,t=0.41)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且存活率均在85.0%以上。由于3 d后漿母細(xì)胞將快速死亡，因此第2步驟培養(yǎng)不超過3 d。步驟3：為了避免漿母細(xì)胞發(fā)生快速死亡，先洗滌細(xì)胞，并加入IL-2、IL-6、IFN-α、April培養(yǎng)3 d，此階段60.0%細(xì)胞將死亡。添加細(xì)胞生長因子并不能提高細(xì)胞存活率。IL-6、IFN-α促進(jìn)表達(dá)CD138的漿細(xì)胞生成，而添加IL-21并不能提高漿細(xì)胞的生成和存活率(21.0%)，換用April使細(xì)胞存活率達(dá)39.0%，存活的細(xì)胞主要由69.5% CD20-CD38++組成，其中40.1% CD20-CD38+CD138++。見表1，圖1、2。

表1 優(yōu)化體外B細(xì)胞增殖分化為漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞的步驟(n=9)

圖1 漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞形態(tài)

圖2 B細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化表面標(biāo)記分子

3 討論

B細(xì)胞在外周血、骨髓、次級淋巴組織中循環(huán)，接觸抗原后增殖分化為漿母細(xì)胞，漿母細(xì)胞進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞，而漿細(xì)胞是體液免疫的終末效應(yīng)物。如果沒有合適的條件及環(huán)境，B細(xì)胞在體外存活時(shí)間非常短暫，極大限制對B細(xì)胞終端體外分化的軌跡研究[4]。本課題組通過對B細(xì)胞激活信號和細(xì)胞因子組合的研究，在以往的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用3個(gè)步驟建立從B細(xì)胞增殖分化成漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞的體外模型。

B細(xì)胞向漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞的增殖分化受到提供CD40L的濾泡輔助T細(xì)胞的幫助和細(xì)胞因子提供的信號整合調(diào)節(jié)，共刺激分子和細(xì)胞因子可以促進(jìn)B細(xì)胞的存活、增殖以及分化。CD40L是輔助T細(xì)胞表面配體刺激幼稚B細(xì)胞以及記憶B細(xì)胞增殖，但不能誘導(dǎo)漿細(xì)胞分化[5]。首先用表達(dá)CD40L的飼養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞支持人類骨髓干細(xì)胞的長期培養(yǎng)。CpG可以刺激非T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞的增殖分化，并在后期提示誘導(dǎo)分泌IgM的增加。有研究[6]顯示,僅用CpG刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞7 d后，B細(xì)胞明顯增殖并分化為漿母細(xì)胞和分泌的免疫球蛋白，CpG上調(diào)了編碼BLIMP-1的PRDM1的表達(dá)，而BLIMP-1是漿細(xì)胞分化至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子。在步驟1中將實(shí)驗(yàn)分為2組，CD40L組及CD40L+CpG組，分別加入IL-2、IL-4，已經(jīng)有研究[7]提示，IL-2、IL-4可以通過ERK/ELK1信號通路的BACH2刺激活化的B細(xì)胞增殖。增殖4 d后從倒置顯微鏡上可以看到B細(xì)胞體積逐漸增大，大小均勻，由分散生長逐漸趨化成團(tuán)狀，兩組細(xì)胞形態(tài)無明顯差別，細(xì)胞存活率均>95.0%。

目前報(bào)道有各種方法激活信號和細(xì)胞因子組合，以獲取最大數(shù)量的漿細(xì)胞[8]。漿母細(xì)胞在外周血中如果沒有受到趨化因子受體表達(dá)的影響被招募到黏膜或骨髓中，在外周血中存活時(shí)間非常短。正因?yàn)檫@些環(huán)境為漿母細(xì)胞提供生存的必要條件，使其進(jìn)一步分化成為持久存活成熟的漿細(xì)胞。研究表明[9]表達(dá)CD40L和CD4+T細(xì)胞為B系統(tǒng)提供強(qiáng)大的共刺激信號CD40L和B細(xì)胞表面表達(dá)的CD40結(jié)合可使幼稚B細(xì)胞以及記憶B細(xì)胞增殖，但不會誘導(dǎo)漿細(xì)胞分化，也有研究表明[5，10]CpG在后期會抑制B細(xì)胞分化。在步驟2中，首先去除CD40L及CpG，并清洗細(xì)胞。自2000年以來，已經(jīng)有較多T細(xì)胞對B細(xì)胞的幫助進(jìn)行詳盡的研究，并發(fā)現(xiàn)IL-21被認(rèn)為是重要的細(xì)胞因子，人類B細(xì)胞向分泌抗體的漿細(xì)胞分化的重要因素。IL-21通過STAT1、STAT3、STAT5以及MAPK/ERK和P13K/Akt途徑，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、漿細(xì)胞分化以及大多數(shù)細(xì)胞分泌[11]。第7天可以觀察到CD40L組及CD40L+CpG組細(xì)胞形態(tài)大小基本相同，表面光滑，可見成簇細(xì)胞。在步驟2中加入不同細(xì)胞因子組合，已發(fā)表的文獻(xiàn)提示[10]，IL-6、IFN-α可以促進(jìn)漿細(xì)胞分化，本研究對比后發(fā)現(xiàn)在步驟2中加入IL-6、IFN-α對漿細(xì)胞的分化沒有明顯影響。在IL-21 存在的情況下，CD40L誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞團(tuán)塊形成，但它既不促進(jìn)B細(xì)胞增殖，也不誘導(dǎo)漿細(xì)胞形成人漿細(xì)胞及其前體在體液免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。流式細(xì)胞儀分析可見CD20-CD38++CD138-漿母細(xì)胞階段。

在步驟3中，CD40L組和CD40L+CpG組細(xì)胞形態(tài)基本相同，細(xì)胞存活率均>30%。有研究[12]表明，表達(dá)CD40L和分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞為B系統(tǒng)提供強(qiáng)大的共刺激信號CD40L和B細(xì)胞表面表達(dá)的CD40結(jié)合可使幼稚B細(xì)胞以及記憶B細(xì)胞增殖，但不會誘導(dǎo)漿細(xì)胞分化，April是腫瘤壞死因子家族成員，作為增殖誘導(dǎo)配體，在漿細(xì)胞的分化及抗體類別轉(zhuǎn)換的作用越來越受到重視[13]。用April培養(yǎng)3 d，在建模第10天CD20-CD38++CD138++漿細(xì)胞表達(dá)增加。通過檢測提示獲得的漿細(xì)胞優(yōu)先來源于記憶B細(xì)胞，并具有類似于人骨髓漿細(xì)胞的CD138++表型通過模仿T細(xì)胞的輔助功能提供CD40L，樹突細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，來模仿B細(xì)胞增殖和分化過程。除了研究B細(xì)胞體外增殖分化外，該體外模型同樣對進(jìn)一步了解多發(fā)性骨髓瘤中漿細(xì)胞發(fā)育不良的分子學(xué)具有重要意義，而尋找多發(fā)性骨髓瘤骨髓環(huán)境是否可以在體外觸發(fā)這些漿細(xì)胞存活[14]，也將帶給研究人員新的思路。