何 迪，李 斌，喻鎂佳，陳 琪

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，病情兇險(xiǎn)，易復(fù)發(fā)，具有嚴(yán)重致死性，其發(fā)病率逐年上升[1]。目前AML治療進(jìn)展緩慢，常用治療方法有聯(lián)合化療、誘導(dǎo)分化和造血干細(xì)胞移植等，盡管對(duì)AML的生物學(xué)特征的理解日漸深入，新的靶向治療藥物被研發(fā)使用，但總體生存率仍低、治療效果仍然不夠理想[2]。研究[3]表明白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)是白血病細(xì)胞惡性增殖的罪魁禍?zhǔn)?，而這些細(xì)胞具有高增殖、低凋亡、分化阻滯、耐藥等特性，導(dǎo)致白血病患者在放化療得到完全緩解后復(fù)發(fā)率仍非常高。因此，闡明調(diào)控LSCs增殖凋亡分子機(jī)制，對(duì)AML的治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNAs)調(diào)控多種生物學(xué)行為，如發(fā)育的進(jìn)程、干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、疾病以及腫瘤發(fā)生等，近些年受到廣泛關(guān)注。miR-193a-5p作為miRNAs的一員，以同源盒基因A7(homeobox protein hox-A7,HOXA7)作為靶基因?qū)β殉舶?、胰腺癌、前列腺癌等癌?xì)胞的增殖凋亡進(jìn)行調(diào)控[4-7]，但是其在AML中的作用以及對(duì)LSCs增殖凋亡的影響尚不得知。該研究在AML細(xì)胞系THP-1上探究miR-193a-5p對(duì)LSCs增殖凋亡的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 白血病骨髓樣本來(lái)自2019年1月—2021月7月云南大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科行骨髓穿刺的52例初治AML受檢者，其中男28例，女24例；年齡34～58(41.32±4.97)歲；正常骨髓樣本來(lái)自同期血液內(nèi)科行骨髓穿刺的50名健康志愿者，其中男29例，女21例；年齡31～56(43.01±5.28)歲。上述骨髓樣本的取材均獲得受檢者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 HEK293T細(xì)胞與THP-1細(xì)胞購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司；慢病毒載體由北京博恒科創(chuàng)生物科技有限公司制備；質(zhì)粒由北京博恒科創(chuàng)生物科技有限公司制備。GAPDH、Caspase-3和PARP-1抗體購(gòu)自北京沃卡威生物技術(shù)有限公司；Annexin Ⅴ-PI凋亡染色試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自上海圣爾生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海弗元生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 組織勻漿機(jī)購(gòu)自北京中科科爾儀器有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1熒光素酶活性檢測(cè) HEK293T細(xì)胞用含100 g/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、50 g/L的飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。查找HOXA7基因序列并通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction,PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入熒光素酶報(bào)告載體pGL3，構(gòu)建野生型HOXA7載體，同時(shí)對(duì)HOXA7序列中與miR-193a-5p結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行TCACG到ATGGC的點(diǎn)突變，構(gòu)建突變載體，按照操作說(shuō)明使用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM3000將質(zhì)粒與miR-193a-5p mimic或mimic-NC共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h，利用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2THP-1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染處理 THP-1細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞株，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組、HOXA7 shRNA組、聯(lián)合過(guò)表達(dá)組?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒空載體；miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-193a-5p過(guò)表達(dá)慢病毒載體；HOXA7 shRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOXA7 shRNA慢病毒載體；聯(lián)合過(guò)表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-193a-5p過(guò)表達(dá)慢病毒載體和HOXA7過(guò)表達(dá)慢病毒載體。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-193a-5p和HOXA7的表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 骨髓樣本采用磁珠法分離骨髓細(xì)胞中的CD34+CD38-細(xì)胞。分別取分離的CD34+CD38-細(xì)胞和THP-1細(xì)胞，采用Trizol法提取心臟組織或者細(xì)胞中RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-193a-5p和HOXA7表達(dá)水平，以GAPDH和U6作為內(nèi)參。miR-193a-5p引物：上游5′-CGGAGCCAAGATTTGATCGA-3′，下游5′-GTGCGCCTGATAAGTAGCAA-3′；HOXA7引物：上游5′-ATGCACCTGCAGAGGTATAG-3′，下游5′-AGAGGAGGTTCGCAACTCTA-3′；GAPDH引物：上游5′-CGCCGTATCTGATGGCGT-3′，下游5′-CGGGAGTCTAGCAGAGTTGACTA-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′。

1.2.4Western blot檢測(cè) 分別取分離的CD34+CD38-細(xì)胞和THP-1細(xì)胞，然后加入1 ml RIPA裂解液，使用組織勻漿機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行勻漿，勻漿后的細(xì)胞放于冰上裂解5 min，之后4 ℃，在10 000 r/min速度下離心5 min，取上清液；然后往上清液中加入loading buffer(上清液體積 ∶loading buffer體積=4 ∶1)；SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，之后依次加入抗人Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、PARP-1抗體(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育12 h，然后使用HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光檢測(cè)。

1.2.5CCK-8檢測(cè) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組的THP-1細(xì)胞增殖情況，具體步驟如下：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)80%時(shí)，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.2.6細(xì)胞計(jì)數(shù) 取培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下對(duì)各組培養(yǎng)孔中細(xì)胞進(jìn)行拍照，然后收集細(xì)胞，離心，棄培養(yǎng)基，用PBS重懸細(xì)胞，然后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)各組細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7THP-1細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至實(shí)驗(yàn)截止時(shí)，收集細(xì)胞，然后立即使用Annexin Ⅴ-PI凋亡染色試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒并采用綠色FITC標(biāo)記熒光檢測(cè)法對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行染色。流式細(xì)胞術(shù)分析：使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析，采用固定流速(6 ml/min)，收集1 min，Q1+Q2+Q3細(xì)胞即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞。TUNEL染色分析：具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡狀況。

2 結(jié)果

2.1 各組熒光素酶活性比較熒光素酶檢測(cè)顯示，miR-193a-5p mimic能夠降低HOXA7野生型熒光素酶活性(P<0.01)，而對(duì)HOXA7突變型熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組熒光素酶活性比較

2.2 AML患者骨髓細(xì)胞中miR-193a-5p及HOXA7表達(dá)水平變化AML骨髓CD34+CD38-細(xì)胞中miR-193a-5p表達(dá)水平低于健康志愿者骨髓CD34+CD38-細(xì)胞中水平，而AML骨髓CD34+CD38-細(xì)胞中HOXA7 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于健康志愿者骨髓CD34+CD38-細(xì)胞中水平(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 AML患者骨髓細(xì)胞中miR-193a-5p及HOXA7表達(dá)水平變化

2.3 各組THP-1細(xì)胞中miR-193a-5p及HOXA7表達(dá)水平變化miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組和聯(lián)合過(guò)表達(dá)組THP-1細(xì)胞中miR-193a-5p表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(P<0.01)；聯(lián)合過(guò)表達(dá)組THP-1細(xì)胞中HOXA7 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，而miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組及HOX7A shRNA組HOXA7 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組THP-1細(xì)胞中miR-193a-5p及HOXA7表達(dá)水平變化

2.4 各組THP-1細(xì)胞增殖情況比較與空白對(duì)照組比較，miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組及HOXA7 shRNA組THP-1細(xì)胞增殖受到抑制且細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)；聯(lián)合過(guò)表達(dá)組THP-1細(xì)胞增殖以及細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)于空白對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組THP-1細(xì)胞增殖情況比較

2.5 各組THP-1細(xì)胞凋亡情況比較miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組及HOXA7 shRNA組THP-1細(xì)胞凋亡比例高于空白對(duì)照組，且HOXA7 shRNA組THP-1細(xì)胞凋亡比例高于miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組(P<0.01)；聯(lián)合過(guò)表達(dá)組THP-1細(xì)胞凋亡百分比分別低于空白對(duì)照組、miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組及HOXA7 shRNA組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 各組THP-1細(xì)胞凋亡情況比較

2.6 各組THP-1細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況比較miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組及HOXA7 shRNA組THP-1細(xì)胞活化的Caspase-3和PARP1量高于空白對(duì)照組，且HOXA7 shRNA組THP-1細(xì)胞活化的Caspase-3和PARP1量高于miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組(P<0.01)；聯(lián)合過(guò)表達(dá)組THP-1細(xì)胞活化的Caspase-3和PARP1量分別低于空白對(duì)照組、miR-193a-5p過(guò)表達(dá)組及HOXA7 shRNA組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 各組THP-1細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況比較

3 討論

近年來(lái)，miRNAs在AML發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的作用受到了廣泛關(guān)注。作為miRNA的一員，miR-193a-5p在腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)過(guò)程中展現(xiàn)出較為重要作用。研究[8-10]表明，miR-193a-5p在卵巢癌、肝癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平降低，且上調(diào)腫瘤細(xì)胞中miR-193a-5p水平后可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，表明miR-193a-5p具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的能力。研究[11]表明，AML初發(fā)和復(fù)發(fā)患者血漿miR-193a-5p表達(dá)水平低于緩解AML患者或健康受試者血漿水平，但miR-193a-5p在LSCs增殖生長(zhǎng)過(guò)程中的作用尚不得知。

HOXA7作為HOX基因家族的一員，是造血細(xì)胞增殖分化的主控基因。研究[12]表明，HOXA7在白血病中的表達(dá)及功能受多種上游因子的調(diào)控，可在各種協(xié)同作用分子或HOX基因的影響下作用于下游靶基因，參與白血病的發(fā)生發(fā)展。HOXA7可影響白血病的臨床表現(xiàn)，且其表達(dá)水平與白血病的治療與預(yù)后有較大關(guān)聯(lián)[13]。此外，HOXA7在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中扮演重要角色[14]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HOXA7是miR-193a-5p直接作用的靶分子。miR-193a-5p通過(guò)結(jié)合HOXA7基因的TCACG位點(diǎn)，調(diào)節(jié)HOXA7的mRNA及蛋白表達(dá)水平。本研究的熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-193a-5p不影響結(jié)合位點(diǎn)突變的HOXA7熒光素酶活性，卻能降低野生型HOXA7熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)證明miR-193a-5p具有調(diào)控HOXA7的功能。AML患者和健康受試者骨髓中LSCs(CD34+CD38-細(xì)胞)miR-193a-5p表達(dá)水平的比較結(jié)果顯示，AML患者骨髓CD34+CD38-細(xì)胞內(nèi)miR-193a-5p表達(dá)水平降低，而HOXA7表達(dá)水平升高。

進(jìn)一步THP-1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-193a-5p或抑制HOXA7表達(dá)能夠抑制THP-1細(xì)胞增殖、促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和PARP1活化及細(xì)胞凋亡，這與之前研究人員[15]關(guān)于HOXA7的功能相一致。但是同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-193a-5p和HOXA7時(shí)，miR-193a-5p對(duì)THP-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響作用則消失，甚至同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-193a-5p和HOXA7時(shí)反而進(jìn)一步促進(jìn)了THP-1細(xì)胞增殖，THP-1細(xì)胞凋亡則被抑制?？紤]到HOXA7具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的功能，發(fā)生這種現(xiàn)象的解釋是miR-193a-5p可通過(guò)抑制HOXA7的表達(dá)繼而抑制THP-1細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)過(guò)表達(dá)HOXA7時(shí)抵消了miR-193a-5p的生物學(xué)作用，而過(guò)表達(dá)的HOXA7進(jìn)一步促進(jìn)了THP-1細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。

綜上所述，miR-193a-5p在AML患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)量降低，其可通過(guò)抑制HOXA7表達(dá)抑制THP-1細(xì)胞增殖、促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡。本研究為臨床治療AML提供了新的思路。