徐建麗，袁海龍，王洪波，陳 剛，楊蕊雪，古力巴旦木·艾則孜，曲建華，江 明

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心,2新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所，烏魯木齊 830054）

單倍體造血干細(xì)胞移植(Haplo-HSCT)因?yàn)槠涔┱咭撰@得性，被全世界接受并成為目前異基因造血干細(xì)胞移植的主流選擇。與全相合造血干細(xì)胞移植相比，Haplo-HSCT 通常具有更強(qiáng)的移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效應(yīng)，然而急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD）的發(fā)生率及植入失敗率高于全相合移植[1-2]，影響移植效果。aGVHD 關(guān)鍵在于宿主T 細(xì)胞的活化和功能異常，在一定程度上是由于人類白細(xì)胞抗原(HLA)不合造成，同時(shí)大量的細(xì)胞因子也參與aGVHD 的發(fā)生。因此，尋找能夠及時(shí)診斷疾病，甚至在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前預(yù)測(cè)aGVHD的臨床指標(biāo)至關(guān)重要。

本研究自2002年設(shè)計(jì)并逐步完善了親緣間HLA單倍體相合非體外去T 細(xì)胞高劑量外周血造血干細(xì)胞移植(related HLA-haploidentical non T cell-depleted in vitro high dose peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HDPSCT)模式，取得了較好的臨床療效[3-5]。本文收集了2004 年1 月－2017年12 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科收治的154 例患者，回顧性分析移植后血清PD-L1、PD-1 水平，以探討是否對(duì)Haplo-HDPSCT 患者發(fā)生aGVHD具有預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2004年1月－2017年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行親緣間HLA 單倍體相合非體外去T 細(xì)胞高劑量外周血造血干細(xì)胞移植(Haplo-HDPSCT)治療的154 例患者，分析截止到2019 年6月的aGVHD 發(fā)病率、發(fā)生部位，以及發(fā)生aGVHD 后血清PD-L1、PD-1 水平。患者主要臨床特征見(jiàn)表1。這項(xiàng)研究符合赫爾辛基宣言規(guī)定，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有移植受者均簽署書(shū)面知情同意。

表1 親緣HLA單倍體相合異基因外周血造血干細(xì)胞移植患者的臨床特征

1.2 預(yù)處理方案201 例患者采用Ara-c+Bu/Cy 方案：阿糖胞苷（Ara-c）2～4 g/m2靜脈滴注(－9 d～－8 d)；白消安(Bu)4 mg·kg-1·d-1，分4 次口服，或3.2 mg·kg-1·d-1，分4 次靜脈滴注(－7 d～－5 d)；環(huán)磷酰胺（Cy）1.8 mg·m-2·d-1靜脈滴注(－3 d～－2 d)；4例受者用TBI/Cy 方案：全身照射（TBI）為單次照射，除1 例為9 Gy(－1 d)，其余3 例劑量均為8.5 Gy，Cy 用法同上；2～3個(gè)位點(diǎn)不合者均應(yīng)用兔抗人胸腺免疫球蛋白(rATG)2.5 mg·kg-1·d-1靜脈滴注(－4 d～－1 d)，1 個(gè)位點(diǎn)不合者則不用rATG。

1.3 干細(xì)胞的動(dòng)員、采集應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對(duì)供者進(jìn)行外周血造血干細(xì)胞(PBSC)動(dòng)員，劑量為7～10 μg·kg-1·d-1，于動(dòng)員后第5和第6天用血液細(xì)胞分離機(jī)進(jìn)行PBSC單采，如果供者體重明顯低于受者體重，則在動(dòng)員后第4天開(kāi)始采集，共采集3 d已達(dá)到預(yù)期的PBSC數(shù)量。設(shè)定輸注的采集物中有核細(xì)胞計(jì)數(shù)(MNC)≥12×108/kg或CD34+細(xì)胞≥6×106/kg。

1.4 GVHD 預(yù)防與治療患者均予以的環(huán)孢素A(CsA)/他克莫司(Tac)+短程甲氨蝶呤(MTX)+嗎替麥考酚酯(MMF)+糖皮質(zhì)激素(GC)作為基礎(chǔ)方案：起始量CsA 2.5 mg·kg-1·d-1靜滴或Tac 0.02 mg·kg-1·d-1靜滴，根據(jù)血藥濃度進(jìn)行劑量調(diào)整；MMF 1 000 mg/d分兩次口服（－2 d～+100 d)；MTX 15 mg/m2靜滴(+1 d)，10 mg/m2(+3 d，+6 d，+11 d)，地塞米松3 mg·m-2·d-1靜滴(+1 d～+30 d，分兩次)，白細(xì)胞恢復(fù)后改為強(qiáng)的松口服逐漸減量直至停用；2～3個(gè)抗原不合者常規(guī)加用抗CD25單克隆抗體20 mg/d靜滴(01 d，+2 d)。aGVHD的診斷分度和器官分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考Glucksberg等西雅圖標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.5 血清中生物標(biāo)志物的水平檢測(cè)檢測(cè)移植后30 d、60 d、90 d 采集患者外周血，血清樣本采集后凍存于－80℃冰箱中，按照CBA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中PD-L1、PD-1水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算患者aGVHD 累積發(fā)生率、總生存率（OS）、無(wú)病生存率（DFS），采用Kapalan-Meier法繪制生存曲線，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，通過(guò)受試者工作特征(ROC)評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植后造血重建情況及生存情況154 例患者中除1例患者植入失敗，其余患者均植入成功。所有患者連續(xù)3 d 檢測(cè)中性粒細(xì)胞≥0.5×109/L 的中位時(shí)間為13 d（8～25 d）；血小板≥20×109/L的中位時(shí)間為16 d（8～31 d）；3 年的DFS 和OS 率分別為(64.62±3.93）%、（66.41±3.79）%。

2.2 aGVHD 的發(fā)生情況發(fā)生aGVHD 患者共94例，中位發(fā)生時(shí)間為45 d(6～95 d),其中發(fā)生I 度aGVHD 患者45例，Ⅱ～Ⅳ度aGVHD 患者49例，Ⅲ～Ⅳ度aGVHD 患者14 例。I～I(xiàn)V 度aGVHD 累積發(fā)生率為(61.04±3.92)%，其中II～I(xiàn)V 度aGVHD 累積發(fā)生率為(37.69±4.50)%，III～I(xiàn)V 度aGVHD發(fā)生率為(11.69±3.05)%，見(jiàn)圖1。發(fā)生aGVHD94例患者中皮膚型aGVHD有66例，腸道型aGVHD有15例，肝臟型aGVHD有13 例。皮膚型aGVHD累積發(fā)生率為(48.51±4.36)%，腸道型aGVHD累積發(fā)生率為(16.09±3.49)%，肝臟aGVHD累積發(fā)生率為(14.47±3.05)%，見(jiàn)圖2。

圖1 移植后aGVHD的發(fā)生情況

圖2 移植后不同受累部位aGVHD發(fā)生情況

2.3 PD-1、PD-L1 水平與aGVHD 關(guān)系總共收集了68 例患者的血清樣本，26 例患者發(fā)生aGVHD，其中4 例患者發(fā)生III～I(xiàn)V 級(jí)aGVHD?；仡櫺詸z測(cè)所有患者移植后30 d、60 d、90 d 的PD-L1、PD-1 血清水平，PD-L1 水平在發(fā)生aGVHD 及未發(fā)生aGVHD 患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。aGVHD 患者移植后30 d的PD-1 平均水平為(96.40±13.00) pg/mL，無(wú)aGVHD 患者的血清水平為(46.77±9.61)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。此外，移植后60dPD-1血清水平在未發(fā)生aGVHD 與I～I(xiàn)I 級(jí)aGVHD 患者中無(wú)明顯差別，但I(xiàn)II～I(xiàn)V級(jí)aGVHD患者的PD-1水平明顯高于無(wú)aGVHD患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。aGVHD 與未發(fā)生aGVHD 患者比較，PD-1 的曲線下面積(AUC)在移植后30 d 和移植后60 d 為0.857(P=0.048)和0.750(P=0.033)，表明PD-1 血清水平可以用來(lái)預(yù)測(cè)aGVHD，見(jiàn)圖3。

圖3 血清PD-1水平預(yù)測(cè)aGVHD發(fā)生的ROC曲線圖

表2 aGVHD發(fā)生后PD-1、PD-L1動(dòng)態(tài)變化（pg/mL,)

表2 aGVHD發(fā)生后PD-1、PD-L1動(dòng)態(tài)變化（pg/mL,)

表3 分層分析發(fā)生aGVHD患者PD-1變化（pg/mL,)

表3 分層分析發(fā)生aGVHD患者PD-1變化（pg/mL,)

3 討論

單倍體相合外周血造血干細(xì)胞移植(Haplo-PBSCT)近年來(lái)得到了迅速的發(fā)展，GVHD 及植入失敗仍是影響療效的關(guān)鍵問(wèn)題。新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心獨(dú)特的親緣間HLA 單倍體相合非體外去T 細(xì)胞高劑量外周血造血干細(xì)胞移植(Haplo-HDPSCT)模式：（1）輸注粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員高劑量供者非體外去T 細(xì)胞外周血造血干細(xì)胞;（2）2～3 個(gè)位點(diǎn)不合者采用TBI/Cy 或Ara-c+Bu/Cy+ATG，而1 個(gè)位點(diǎn)不合者不加ATG 作為清髓性預(yù)處理方案;（3）2～3個(gè)位點(diǎn)不合者采用CsA/Tac+短程MTX+MMF+抗CD25 單克隆抗體+GC 作為加強(qiáng)的GVHD 預(yù)防方案，而1 個(gè)位點(diǎn)不合者則不常規(guī)加用抗CD25 單克隆抗體作為GVHD 預(yù)防方案;（4）應(yīng)用加強(qiáng)的細(xì)菌、真菌和病毒等感染防控措施，取得了較好的臨床療效，植入率好，重度aGVHD發(fā)生率不高。本研究的移植模式中使用高劑量的外周血造血干細(xì)胞作為移植物可以克服移植排斥導(dǎo)致的植入失敗[7]，但因含有大量供者T 淋巴細(xì)胞，從而也會(huì)增加aGVHD 發(fā)生率，而使用ATG 可以克服HLA 不合，使體內(nèi)T 細(xì)胞耗竭。常規(guī)應(yīng)用二次巴利昔單抗及短程的激素，有明確的抗GVHD 作用，并且可以持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間，方案中GCSF 也可以促進(jìn)T 細(xì)胞向Th2 型轉(zhuǎn)化，一定程度上降低aGVHD 的發(fā)生率。本研究中，雖然總的aGVHD 的累計(jì)發(fā)生率略高，為(61.04±3.92）%，但Ⅲ～Ⅳ度aGVHD 的累計(jì)發(fā)生率不高，且以皮膚型aGVHD 為主，臨床上易于治療，并發(fā)癥少，表明此種移植模式是可行的。

由于GVHD 仍然是移植后非復(fù)發(fā)死亡的主要死亡原因，因此尋找能夠預(yù)測(cè)GVHD發(fā)生的生物標(biāo)記物顯得尤為重要。據(jù)報(bào)道，大量的血漿生物標(biāo)記物可以以不同的準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)aGVHD，如致癌抑制因子2(ST2)、TNF-α和人再生胰島衍生蛋白3α(REG3α)、IL-10、IL-9[8-15]。程序性死亡受體-1(PD-1)與程序性死亡受體-配體1(PD-L1)是共刺激分子B7 家族重要成員，在同種異體造血干細(xì)胞移植后維持免疫耐受中起著重要作用[16-17]，它們作為一對(duì)負(fù)性共刺激分子，促進(jìn)IL-10 分泌的Th2 型細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制Th1 型細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞向Th2型細(xì)胞極化[23]，從而降低移植后GVHD 的發(fā)生率[18]。Zhou 等[19]報(bào)道Haplo-HSCT的北京移植方案在移植后第7天PD-L1血清水平可預(yù)測(cè)III～I(xiàn)V 級(jí)aGVHD。幾項(xiàng)小鼠模型研究表明，PD-1 及PD-L1 在移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)和GVHD 中起雙重作用[20-22]。然而，由于眾多研究者報(bào)道了不同的觀點(diǎn)，這一問(wèn)題仍然存在爭(zhēng)議。在本研究中，PD-L1 水平在發(fā)生aGVHD 與未發(fā)生aGVHD 患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PD-1 水平在移植后30 d發(fā)生aGVHD 患者高于未發(fā)生aGVHD 患者，發(fā)生aGVHD 與未發(fā)生aGVHD 患者在移植后60 d PD-1 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而對(duì)發(fā)生aGVHD 患者進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示III～I(xiàn)V 級(jí)aGVHD 患者在移植后60 d時(shí)血清PD-1水平高于未發(fā)生aGVHD 患者，提示移植后PD-1血清水平可預(yù)測(cè)aGVHD的發(fā)生。

本研究所采用的Haplo-HDPSCT 模式，重度aGVHD 發(fā)生率較低，以皮膚型aGVHD 為主，OS 率及DFS 率較高，證明該移植模式治療惡性血液病有效、安全、可行，移植后PD-1 水平的升高對(duì)預(yù)測(cè)早期臨床aGVHD可提供幫助。